铁皮石斛快繁及多糖含量测定

黄以平

（福州植物园，福建 福州350012）

铁皮石斛Dendrobium officinale Kimuraet Migo.为兰科石斛属，多年生草本植物，以新鲜或干燥茎入药。为药典收载且单独列为一类的名贵中草药之一，其性甘，微寒，归胃、肾经，功能益胃生津，滋阴清热，用于阴伤津亏，口干烦渴，食少干呕，病后虚热，目暗不明等症。多糖是其主要活性成分［1-2］，总多糖含量的高低是目前铁皮石斛质量评价的主要指标［3-4］。本实验对铁皮石斛进行了组织培养，并参照2010年版《中华人民共和国药典》铁皮石斛项下，测定了铁皮石斛组培苗多糖的含量，初步分析铁皮石斛组培苗的药用价值，为铁皮石斛优良种质资源的选育和资源开发奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药522AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；TU-1901新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；PL203型电子分析天平（METTLER TOLEDO上海公司）；SG5200 HPT型超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）；80-2B型离心机（上海安亭科学仪器厂）；SHBB95A型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；YB-2恒温真空干燥箱（上海纽航仪器设备有限公司）；葡萄糖、苯酚、浓硫酸、石油醚、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、丙酮、正丁醇等试剂均为分析纯。

1.2 铁皮石斛组织培养

1.2.1 铁皮石斛外植体增殖培养 取组培苗圃地中生长的铁皮石斛新鲜芽茎段，流水冲洗1 h，在超净工作台上用75%酒精处理1 min，再用0.1%升汞液浸泡12～15 min，倒去升汞液，用无菌水冲洗4～5次，每次不少于5 min，后用无菌纸吸干备用。将消毒好的茎段切除上下端各0.5cm后接种到培养基MS＋6-BA 2.0mg/L＋NAA 0.2mg/L＋蔗糖25g/L＋活性炭0.5g/L＋琼脂10g/L（pH5.5～5.8）中诱导腋芽发生，培养温度为25℃，光照12～16 h/d，1600 lx。约60 d后，转接至培养基MS＋6-BA 4.0mg/L＋NAA 0.2mg/L＋蔗糖25g/L＋活性炭0.5g/L＋琼脂10g/L（pH 5.8）中继代培养，每5周1次，得未发根的组培苗。

1.2.2 铁皮石斛生根培养 取增殖所得铁皮石斛组培苗转接至基本培养基1/2MS＋NAA 0.2mg/L＋香蕉泥100g/L＋蔗糖30g/L＋活性炭1g/L＋琼脂10g/L（pH 5.8）中进行生根培养，培养温度为25℃，光照12 h/d，2500 lx，得发根组培苗。

1.3 多糖含量测定［5］

1.3.1 供试样品 采集至组培苗圃地生长2年半、3年半的铁皮石斛茎叶，本实验所得未发根组培苗茎叶和发根组培苗（发根组培苗完整植株，分为茎上、茎中、茎下和根部4部分）。将各样品（其中未发根组培苗和发根组培苗不进行炼苗，直接用于多糖含量测定）清洗干净，干燥后，粉碎过3号筛，供测定多糖含量。

1.3.2 样品溶液的制备 取样品粉末约0.3g，精密称定，加水200mL，加热提取2 h，提取液转移至250mL量瓶中，用适量水分次洗涤容器，洗液转移至同一量瓶中；放冷，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液2mL，置15mL离心管中；精密加入无水乙醇10mL，摇匀，冷藏1 h，取出，离心（4000 rpm）20 min，弃去上清液，必要时滤过，沉淀加80%乙醇洗涤2次，每次8mL，离心，弃去上清液，沉淀加热水溶解并转移至25mL量瓶中；放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得样品溶液。

1.3.3 对照品溶液的配制 取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水溶解并定量，摇匀，制成每1mL中含90 μg的溶液，即得对照品溶液。

1.3.4 检测波长的选择 精密吸取标准葡萄糖溶液0.3mL，置于具塞比色管中，加蒸馏水至2.0mL，再加苯酚试液1.0mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0mL，迅速摇匀，放置5 min，置沸水浴中加热15 min，取出，冷水迅速冷却至室温，作为供试溶液。在400～600 nm范围对供试溶液进行扫描。

1.3.5 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置10mL具塞试管中，加水至1.0mL；精密加5%苯酚溶液1mL，摇匀，再精密加硫酸5mL，摇匀，置沸水浴中加热20 min，取出，放入冰浴中冷却5 min。以相应的试剂为空白，按照紫外－可见分光光度法，在490 nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，得回归方程：Y＝0.0742X－0.0008（r＝0.9980）。

1.3.6 样品测定 精密量取样品溶液1mL，置10mL具塞试管中，按照标准曲线绘制项下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1mL”起，依次测定吸光度，每个样品平行处理3份，取平均值。从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的量，代入回归方程计算葡萄糖的质量浓度，再按下式计算多糖的量：

多糖的量（%）＝CD/W×100%。

式中：C为供试液中葡萄糖的质量浓度（mg/mL）；D为供试液的稀释倍数；W为供试品量。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛增殖培养

2.1.1 外植体组织培养 将外植体接种至增殖培养基，其丛生芽的增殖率高，且生长势好，芽苗浓绿健壮。可对其芽苗进行再增殖，建立快繁体系，30 d左右长出完整茎叶。

2.1.2 铁皮石斛发根 将增殖所得不带根铁皮石斛组培苗接种至1/2 MS培养基上，约20 d左右基部根开始生长，45 d左右苗生长健壮、根系发达。

2.2 方法学考察

2.2.1 最大检测波长 将葡萄糖及铁皮石斛多糖溶液的显色后溶液分别在400～600 nm内扫描，结果在490 nm左右有最大吸收，故选择490 nm为检测波长。

2.2.2 精密度实验 精取供试溶液5份，每份0.3mL，加蒸馏水使成2.0mL，各加苯酚试剂1.0mL，按标准曲线操作，重复5次，测定其吸光度，计算RSD值为1.03%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 重复性实验 精密称取铁皮石斛粉末5份，每份1.0g，按样品溶液制备和测定方法操作，分别测定其含量，结果计算RSD值为3.52%，重现性良好。

表1 重现性试验结果

2.2.4 回收率实验 精密称取已知铁皮石斛粉末5份，分别精密加入不同量的对照品，蒸馏水定容，摇匀，重复测定5次，测定其吸光度并用标准曲线计算含量。测得平均回收率为99.11%，RSD值为1.01%。

表2 加样回收率实验结果（n＝5）

2.2.5 稳定性实验 精取供试溶液0.3mL，加蒸水使成2.0mL，加苯酚试剂1.0mL，按标准曲线操作，每隔30 min测定1次吸收度。测定结果为RSD＝0.92%，测定值在240 min内有较好的稳定性。

表3 稳定性实验结果

2.3 多糖含量的测定 精密量取铁皮石斛各供试品溶液1.0mL，按“1.3.6”项下方法操作，测定吸光度。同时精密量取葡萄糖对照品溶液0.3mL，同法操作，按公式计算各样品的多糖含量，结果见表4。铁皮石斛发根组培苗的茎上、中、下3部分和根部多糖含量有较大差异，而未发根组培苗未检测到多糖。其中发根组培苗各部位多糖含量各不同，多糖含量茎中＞茎上＞茎下＞根部，这与文献［6］报道的基本一致。组培苗圃地生长2年半、3年半的组培苗和发根组培苗的多糖含量分别为25.91%、26.80%和25.09%，可见，随组培苗苗龄的增加，茎叶中多糖含量也随之增加，且均达到药典中铁皮石斛多糖含量的规定。

表4 不同苗龄及部位的铁皮石斛中多糖含量测定结果（n＝3）

3 讨 论

我国铁皮石斛种质资源丰富，但由于自然和人为因素影响，野生铁皮石斛种质资源受到严重威胁。种苗的大量、快速生长已成为规模化生产的关键，而组培快繁技术是解决该问题的最好方法［7］，对铁皮石斛进行增殖培养，在短时间内可得到大量铁皮石斛组培苗。2010年版《中华人民共和国药典》规定：铁皮石斛按干燥品计算，含铁皮石斛多糖以无水葡萄糖（C6H12O6）计，不得少于25.0%。本文利用苯酚-硫酸法测定了铁皮石斛发根组培苗的多糖含量为25.09%，达到药典铁皮石斛多糖含量的规定，且随组培苗苗龄的增加，茎叶中多糖含量也随之增加，铁皮石斛组培苗多糖的药理作用有待于进一步研究。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：265-266.

［2］诸燕，斯金平，郭宝林，等.人工栽培铁皮石斛多糖质量分数变异规律［J］.中国中药杂志，2010，35（4）：427.

［3］陈蕤.石斛多糖提取工艺的研究［J］.中国医药导报，2010，7（12）：40-43.

［4］刘宏源，杨金燕，黄松，等.3，5——二硝基水杨酸法测定铁皮石斛中多糖的含量［J］.亚太传统医药，2010，6（8）：14-16.

［5］吴刚，季祥彪，康冀川，等.石斛中多糖和生物碱的含量测定［J］.山地农业生物学报，2008，27（3）：274-278.

［6］华允芬，陈云龙，张铭.三种药用石斛多糖成分的比较研究［J］.浙江大学学报，2004，38（2）：249-252.

［7］邵华，张玲琪，李俊梅.铁皮石斛研究进展［J］.中草药，2004，35（1）：109-202.