金线莲总黄酮回流提取工艺研究

张秀才，吴岩斌，吴锦玉，吴建国，李 芹，林玉明，梁一池，吴锦忠

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州350122；2.福州市传染病医院，福建 福州350025；3.福州佳乐达生物工程有限公司，福建 福州350001）

金线莲为兰科开唇兰属植物花叶开唇兰Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.的新鲜或干燥全草，是多年生珍稀中草药，具有清热凉血，祛风利湿功效［1］，用于治疗肺结核咯血、糖尿病、肾炎、膀胱炎、重症肌无力、遗精、风湿性及类风湿性关节炎、小儿惊风、妇女白带以及毒蛇咬伤等症［2-3］。金线莲主要分布于亚洲热带和亚热带地区及大洋洲，我国主要分布于东南沿海地区，以福建、台湾居多［4］。近年来随着人为采挖，野生金线莲资源逐年减少，大量人工组织培养金线莲涌现市场。现代化学和药理研究表明：金线莲主要含有黄酮类、糖类、生物碱类、甾体类、三萜类和氨基酸等成分［5-8］，具有降血糖、降血压、抗氧化、保肝、抗炎、抗菌和镇痛等生物活性［8，9］，金线莲黄酮类成分是重要有效成分之一［6］。为了进一步评价金线莲品质，有必要建立金线莲黄酮含量测定方法。本实验采用正交设计法，考察不同因素水平对总黄酮提取率的影响，以总黄酮含量为指标，进行回流提取工艺研究，优化其工艺参数。

1 材料与仪器

1.1 药材 金线莲由福州佳乐达生物工程有限公司提供，经福建中医药大学黄泽豪副教授鉴定，标本保留在福建中医药大学中西医结合研究院。

1.2 试剂 异槲皮苷对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-11121801）；亚硝酸钠（上海三鹰化学试剂有限公司，AR）；硝酸铝、氢氧化钠、甲醇、乙醇（天津市福晨化学试剂厂，AR）；蒸馏水（实验室自制）

1.3 仪器AB204-N电子天平（METTLER TOLEDO上海公司）；双列四孔数显水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）；RE-2000A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SH2-D（Ш）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；DLSB-5/25℃低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司）；UV-1800紫外可见分光光度计（日本岛津公司）。

2 方 法

2.1 标准曲线的制备［10］精密称取干燥至恒重的异槲皮苷对照品10mg置50mL容量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，加甲醇至刻度，摇匀，即得（每1mL中含异槲皮苷0.2mg）。精密量取对照品溶液1、2、3、4、5、6mL，分别置25mL容量瓶中，各加水至6.0mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，混匀，放置6 min；加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6 min；加4%氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min。以相应的试剂为空白，在紫外-可见分光光度下200～800 nm全波长扫描，在最大吸收波长处测定吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，相应浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线并进行一元线性回归。

2.2 供试品溶液的制备 称取干燥的金线莲0.5g，精密称定。按L9（34）正交设计表，加热回流提取，过滤，合并滤液，45℃真空减压浓缩至干，加适量无水甲醇使溶解并转移至10mL容量瓶中，用无水甲醇定容至10mL，作为供试品溶液。

2.3 金线莲总黄酮的含量测定 精密吸取供试品溶液1mL置25mL容量瓶中，照“2.1标准曲线制备”项下的方法，自“加水至6.0mL”起，依法测定吸光度。计算总黄酮提取率（以生药量计）。

2.4 正交试验设计 以总黄酮百分含量为指标，采用回流提取法，考察乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）、提取次数（D）4个因素，每个因素3个水平进行优选，用L9（34）正交试验表设计正交试验，优化最佳提取工艺条件。因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素水平表

2.5 验证实验 称取金线莲3份，按最佳提取工艺条件进行提取，得到3份提取液，按2.2供试品溶液制备项下的方法，自“45℃真空减压浓缩至干”起，制备成供试品溶液；按2.3金线莲总黄酮的含量测定项下的方法，测定总黄酮含量。

3 结果与分析

3.1 最大吸收峰 光谱扫描结果表明：在510 nm处有最大吸收峰。

3.2 标准曲线及回归方程 以吸光度（A）为纵坐标，异槲皮苷浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，进行回归分析，建立回归方程。其线性回归方程为：Y＝0.01707X－0.00495（r2＝0.99991），其中，X为异槲皮苷溶液浓度，Y为吸光值。表明异槲皮苷浓度在8～48mg/L范围内，吸光度值与浓度呈良好线性关系。结果见表2、图1。

表2 不同浓度异槲皮苷的吸光值

图1 异槲皮苷标准曲线

3.3 正交试验最佳提取条件 正交试验结果及直观分析结果，见表3。

表3 L9（34）正交试验结果

由表3可知，极差中D项最大，A项最小，即该4个因素对总黄酮提取率的影响程度大小为：D＞C＞B＞A。表明在该条件下，各因素对金线莲总黄酮提取率影响的主次顺序为：提取次数＞提取时间＞料液比＞乙醇浓度。因乙醇浓度极差最小，故以乙醇浓度为误差列，进行方差分析，结果见表4。

表4 方差分析表

由表4方差分析结果可知，4个因素均对金线莲总黄酮提取率无显著性影响。根据试验结果，综合考虑多种因素，提取金线莲总黄酮最佳工艺为A3B3C3D3，即20倍量的95%乙醇回流提取3次，每次90 min。

3.4 验证实验 为进一步确证该工艺的稳定性和合理性，按最佳提取工艺条件，进行验证实验。结果见表5。

表5 验证实验结果

由表5知，金线莲总黄酮提取率平均值为1.837%，RSD为1.91%，结果表明该提取工艺条件稳定可行。

4 讨 论

近年来，福建省金线莲产业化发展迅猛，2011年以来，在福建省种植业创新与产业化工程“金线莲等药用兰科植物产业化示范与推广项目”带动下，福建省金线莲逐步进入更快、更好地发展，并形成了以漳州南靖为中心，向闽中、闽西和闽北等地区放射性发展的趋势。

中药化学成分有多种的提取方法，其中主要是溶剂回流提取法或结合超声和微波的提取法。溶剂回流提取法操作简便，提取效率高，而且仪器设备简单，为一般药材质量检验实验室所必备，尤其适用于金线莲生产企业对金线莲质量检测。建立溶剂回流提取金线莲黄酮类成分，对金线莲生产企业规范金线莲生产质量及其生产标准操作规程制订提供依据。

金线莲黄酮类成分提取效率受到多因素的影响，如料液比、提取溶剂及其浓度、提取次数和提取时间等，提取效率直接影响其含量测定结果。本实验基于单因素对金线莲黄酮类成分提取率影响，采用正交实验4因素3水平，优选金线莲总黄酮的最佳提取工艺，并利用该最佳工艺验证实验结果。该提取方法操作简单可行，测定结果稳定，为金线莲生产企业提供金线莲质量评价方法。

［1］黄有霖．福建省中药材标准［S］．福州：海风出版社，2006：154．

［2］福建省中医药研究院．福建药物志：第2卷（修订本）［M］．福州：福建科学技术出版社，1994：492-493．

［3］《全国中草药汇编 》编写组．全国中草药汇编［M］．北京：人民卫生出版社，1996：392-393．

［4］中国科学院中国植物志编委．中国植物志：第17卷［M］．北京：科学出版社，2000：204．

［5］龚秀会，许敏，董鸿竹，等．不同基原金线莲植物的化学成分比较研究［J］．安徽农业科学，2012，40（36）：17530-17531．

［6］何春年，王春兰，郭顺星，等．福建金线莲的化学成分研究［J］．中国药学杂志，2005，40（8）：581-582．

［7］关璟，王春兰，郭顺星．福建产金线莲中黄酮苷成分的研究［J］．中草药，2005，36（10）：1450-1453．

［8］张红艳，潘馨．金线莲化学成分及药理活性研究进展［J］．海峡药学，2009，21（1）：82-84．

［9］唐健，邓元荣，卓仪荣．金线莲的药理活性研究进展［J］．海峡药学，2008，12（20）：77-79．

［10］耿红梅，张彦，曹丽慧，等.正交实验优选白花菜子总黄酮的最佳提取工艺［J］．时珍国医国药，2012，23（4）：886-887．