干扰组蛋白去甲基化酶基因表达对Ishikawa细胞增殖凋亡的影响

郑金丹，刘丽丽

1辽宁医学院，辽宁锦州 121000；2辽宁医学院第一附属医院，辽宁锦州 121000

子宫内膜癌(endometrial carcinoma)是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，其病因尚不清楚，长期受雌激素刺激而无孕酮拮抗可能是其主要发病因素。孕激素是保护子宫内膜的重要因素，亦是内分泌治疗子宫内膜癌的重要方法，可使子宫内膜癌腺体向良性逆转[1]。孕激素通过与其受体(progesterone receptor，PR)结合发挥生物学效应，而PR阳性被认为是临床内分泌治疗激素依赖性子宫内膜癌的关键。最近，Stratmann，Haendler[2]在研究人类乳腺癌时发现，乳腺癌细胞中存在JARID1A基因过渡表达，可能与肿瘤的发生有关，沉默JARID1A基因可上调PR表达，抑制肿瘤细胞生长。Sharma在建立肿瘤细胞株对抗癌药物敏感性模型时发现，染色质介导的肿瘤细胞耐药可逆状态需要JARID1A参与[3]。本研究旨在通过SiRNA干扰JARID1A基因表达，探讨其对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖凋亡的影响。

材料和方法

1 材料 人子宫内膜癌高分化细胞系Ishikawa(ER、PR高表达)由北京大学人民医院惠赠。DMEM/F-12培养基、小牛血清购自美国Gibico公司，PR抗体Santa Cruz分装，重组人雌二醇HSD17B1(E2)购自Sigma公司，JARID1A抗体购自Cell signaling，转染试剂盒和DharmaFECT1转染试剂购自Dharmacon公司，四条JARID1A siRNA由Dharmacon公司设计合成。RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司。

2 细胞培养 Ishikawa细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养液置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱培养，细胞密度达到70%以上时传代，实验取对数生长期细胞。

3 SiRNA转染Ishikawa细胞 根据前期工作基础选择1条干扰效果理想的序列进入本实验，空白对照(untr)不作任何处理，阴性对照(siCo)采用不针对任何基因的siRNA。JARID1A siRNA：5'-GCAAAU GAGACAACGGAAA-3'； JARID1A Non-Targeting siRNA：5'-UUCUCCGAACUUGUCACAUUU-3'，转染过程按转染说明书操作。转染成功后将细胞放入CO2培养箱，37 ℃温育24~48 h，进行后续操作。

4 细胞RNA提取及RT-PCR 使用Trizol试剂提取细胞总RNA后，逆转录获得cDNA，按TaKaRa公司RT-PCR试剂盒说明书进行操作。总RNA经紫外分光光度计测OD260和OD280值，两者比值在1.8~2.0之间的RNA纯度为好。反转录使用Oligo(dT)引物，合成cDNA条件为：30 ℃，10 min；42 ℃，30 min；99 ℃，5 min。反转录结束后进行PCR反应，反应体系为20 μl。PCR引物经Gene Bank上的Blast比对后委托TaKaRa公司合成，PCR扩增产物使用1.5%琼脂糖，100伏电泳30 min，EB染色，凝胶成像系统(Bio Imaging System，UVP，USA)观察。以β-actin为内对照，引物见表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 Sequences of PCR primers

5 蛋白提取及Western Blotting 细胞裂解液(pierce)提取细胞内总蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。配制10%的分离胶和5%浓缩胶，每孔加入20 μl样品后进行电泳，转印至PVDF膜上，经封闭后，加入PR多克隆一抗(1∶200)，4 ℃孵育过夜，TTBS洗涤加PR标记的兔抗山羊二抗(1∶2 000)，37 ℃孵育2 h，洗膜后加入ECL发光试剂,蛋白条带用Bio Imaging System采集后进行灰度值测定，目的蛋白与β-actin的灰度值比值即为该样品的蛋白相对含量。

6 CCK8检测Ishikawa细胞增殖 将sicon组、sicon+e2组、siJARID1A组和siJARID1A+e2组的Ishikawa细胞以每孔1 000个细胞密度接种96孔板中，重复种植4个96孔板，分别用来检测24 h、48 h、72 h、96 h细胞的增殖，450 nm条件下检测吸光度值。以时间为横坐标，每组细胞平均吸光值为纵坐标，绘制细胞增殖曲线。

7 流式细胞术检测细胞周期 将sicon组、sicon+e2组、 siJARID1A组和siJARID1A+e2组的Ishikawa细胞培养48 h后，分别加入1 ml PBS，1 500 g离心5 min，弃上清,加入400 μl碘化啶液(PI)，室温避光30 min，流式细胞仪(BD bioscience)检测细胞周期。

8 统计学方法 采用SPSS13.0进行数据处理与统计学分析，计量资料以表示，单因素方差分析，对Ishikawa细胞吸光值进行Fried-man检验，检验水准a=0.05。

结 果

1 干扰效率 Ishikawa细胞转染SiRNA后, JARID1A mRNA表达降低，见图1。

2 E2对PR表达的影响 不同浓度E2均能上调Ishikawa细胞中PR mRNA的表达，在E2浓度100 nmol/L时，PR mRNA上调最明显(P＜0.05),见图2。

3 SiRNA对PR表达的影响 Ishikawa细胞转染JARID1A SiRNA后，PR蛋白表达增加，PR mRNA表达上调，见图3、4。

图1 JARID1A基因干扰效率 与siCo组相比，siJARID1A组中JARID1A mRNA表达明显降低(aP＜0.01)Fig.1 Interference with JARID1A gene expression on proliferation and apoptosis of Ishikawa cells aP＜0.01 vs siCo group

图2 RT-PCR检测PR mRNA表达Fig.2 RT-PCR-detected PR mRNA expression

图3 Western Blot检测PR蛋白表达 与sicon组和sicon+e2组相比较，siJARID1A组和siJARID1A+e2组细胞中PR蛋白表达增加(P＜0.01)Fig.3 Western blot-detected PR protein expression. P＜0.01 vs siCo group and sicon+e2 group

图4 RT-PCR检测PR mRNA表达 与sicon组相比，siJARID1A组中PR mRNA表达增加(aP＜0.01)；与sicon+e2组相比，siJARID1A+e2组PR mRNA表达上调(bP＜0.05)Fig.4 RT-PCR-detected PR mRNA expression aP＜0.01, vs siCo group; bP＜0.05, vs sicon+e2 group

图5 细胞增殖曲线Fig.5 Proliferation curves of Ishikawa cells

图6 细胞周期 与sicon组、sicon+e2组相比，siJARID1A组和siJARID1A+e2组细胞G1、G2/M期受到抑制(aP＜0.01，bP＜0.05)Fig.6 Cell cycle of Ishikawa cells aP＜0.01, vs siCo group; bP＜0.05, vs sicon+e2 group

4 细胞增殖情况 Ishikawa细胞转染JARID1A Si-RNA 48 h后，细胞增殖速度明显减慢，sicon、sicon+e2组细胞在培养48 h后达对数增殖期，而siJARID-1A和siJARID1A+e2组细胞缺乏对数增殖特征，见图5。

5 细胞周期变化 JARID1A siRNA抑制Ishikawa细胞G1、G2/M期，见图6。

讨 论

子宫内膜癌的发病机制尚未阐明，多数学者认为其最常见病因是过量雌激素长期刺激的结果[4]。雌激素可刺激子宫内膜细胞增生，也可在DNA转录水平上诱导下游基因PR的生成，发挥其生物学效应[5]。本研究选取ER、PR均阳性的Ishikawa细胞系，结果证实不同浓度的E2均可以上调PR基因的表达，在E2浓度为100 nmol/L时，PR基因表达上调最明显，提示在PR阳性的子宫内膜癌细胞中，雌激素可上调PR的表达，为临床内分泌治疗子宫内膜癌提供理论依据。

JARID1A属于JARID1蛋白家族成员之一，起初被描述为视网膜母细胞瘤蛋白，有促进肿瘤细胞分化的作用[6]。最近研究证实JARID1A是一种组蛋白去甲基化酶，与其他组蛋白去甲基化酶不同，JARID1A通过自身ARID区域识别一组特殊的CCGCCCDNA序列调控下游基因表达[7-8]。全基因组分析结果表明，JARID1A控制着两组基因，一组涉及细胞分化的调控，另一组调控细胞线粒体的功能及RNA/DNA代谢[9]。本研究应用SiRNA干扰JARID1A基因表达，实验发现干扰JARID1A(si JARID1A、siJARID1A+e2组)能显著增加PR基因表达，上调PR蛋白表达。

肿瘤被认为是一类细胞周期性疾病，肿瘤细胞的主要生物学特性表现为侵袭生长[10]。实验中我们采用MTT法观察Ishikawa细胞增殖，流式细胞技术检测细胞周期。结果发现，E2能促进肿瘤细胞增殖，转染SiRNA 48 h后，肿瘤细胞增殖速度明显减慢，曲线低平，与对照组相比缺乏对数增殖特征；进一步研究发现，转染SiRNA后肿瘤细胞的G1、G2/M期受到抑制。

本研究证实，JARID1A siRNA能有效抑制Ishikawa细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡，是通过上调PR基因表达以拮抗雌激素的生物学效应来完成。JARID1A是如何上调PR基因的表达仍需进一步深入研究，而JARID1A基因的发现则有望成为子宫内膜癌治疗的新靶点。

1 Flötotto T， Niederacher D， Hohmann D， et al. Molecular mechanism of estrogen receptor （ER）alpha-specific， estradiol-dependent expression of the progesterone receptor （PR） B-isoform［J］. J Steroid Biochem Mol Biol， 2004， 88（2）： 131-142.

2 Stratmann A， Haendler B. The histone demethylase JARID1A regulates progesterone receptor expression［J］. FEBS J， 2011， 278（9）： 1458-1469.

3 Sharma SV， Lee DY， Li B， et al. A chromatin-mediated reversible drug-tolerant state in Cancer cell subpopulations［J］. Cell， 2010，141（1）： 69-80.

4 张海艳，李立安，李亚里，等．ER、PR、P53在子宫内膜癌中的表达及对预后的影响［J］.军医进修学院学报，2012，33（1）：27-29，41．

5 Dardes RC， Schafer JM， Pearce ST， et al. Regulation of estrogen target genes and growth by selective estrogen-receptor modulators in endometrial Cancer cells［J］. J Steroid Biochem Mol Biol， 2002，85（3）： 498-506.

6 Christensen J， Agger K， Cloos PA， et al. RBP2 belongs to a family of demethylases， specific for tri-and dimethylated lysine 4 on histone 3［J］. Cell， 2007， 128（6）： 1063-1076.

7 Klose RJ， Yan Q， Tothova Z， et al. The retinoblastoma binding protein RBP2 is an H3K4 demethylase［J］. Cell， 2007， 128（5）：889-900.

8 Tu S， Teng YC， Yuan C， et al. The ARID domain of the H3K4 demethylase RBP2 binds to a DNA CCGCCC motif［J］. Nat Struct Mol Biol， 2008， 15（4）： 419-421.

9 Lopez-Bigas N， Kisiel TA， Dewaal DC， et al. Genome-wide analysis of the H3K4 histone demethylase RBP2 reveals a transcriptional program controlling differentiation［J］. Mol Cell， 2008， 31（4）：520-530.

10 吴艳萍，李立平，张颖，等．细胞周期调控分子与肿瘤关系的研究进展［J］.军医进修学院学报，2006，27（4）：306-308．