肝癌HSP70-肽复合物抗肿瘤研究

黄学珍，刘学政

（1.吉水县双村镇卫生院普外科，江西 吉水331602；2.井冈山大学附属医院神经外科，江西 吉安 343000）

肝癌是临床上常见的恶性度很高的肿瘤，即使进行了根治性手术、规范性放疗和化疗，患者的晚期总会发生肿瘤的转移和复发。其根本原因是患者的免疫功能受到破坏，肿瘤细胞能够逃避机体的免疫监视[1]。因此通过药物或生物制剂的作用，提高肿瘤患者的免疫功能，改变肿瘤患者的免疫低下及免疫缺陷，增强机体对肿瘤细胞免疫力和杀伤力，对抗肿瘤的研究具有重要的指导意义；其次，T细胞介导的免疫反应在机体抗肿瘤作用中起重要作用，因此诱导激活T细胞的主动抗肿瘤作用是提高机体免疫能力的重要环节。本研究通过改良的凝胶梯度洗脱法从手术切取肝癌组织中分离出HSP70-肽复合物并激活T淋巴细胞，观察激活T淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标本肝癌组织系井冈山大学附属医院提供，均经病理诊断为细胞性肝癌。蛋白分子质量Marker（广州华美生物工程公司），DEAE-52纤维素（whatman 分装），SGC-6801 肝癌细胞珠（sigma公司），硝酸纤维素薄膜（上海生物制品所），3H-TdR（美国强生公司）。

1.2 实验方法

1）肝癌HSP70-肽复合物的提取和纯化：取肝癌组织 125 g，匀浆，经 43℃加热 1 h，离心（1 000 r·min-1,10 min）取上清液，5 h后用4倍体积裂解液[0.05 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.2），含 0.05%trypsin、0.1 mmol·L-1PMSF、0.1%NaHPO4·12H2O]裂解细胞，胞膜破裂后高速离心（5 000 r·min-1,15 min）取上清液，用SephadexG-100粉50 g和层析缓冲液100 mL充分搅匀，用玻璃层析柱使其沉降倒除上层混悬液后静止3 d。经DEAE-52 cellulose柱梯度洗脱，测吸光度A值（波长280 nm），收集各峰蛋白，通过对分子质量的鉴定，取相对分子质量70 000组份。

2）T淋巴细胞的提取：用尼龙毛和磁珠交联法分离T淋巴细胞，淋巴细胞分离液常规分离PBMC，将要分离的单个核细胞（PBMC）倒入注射器内，盖上注射器，37℃温育36 min至1 h。将特异性抗T淋巴细胞单克隆抗体与磁性小珠交联形成免疫磁珠，用免疫磁珠从PBMC中结合T淋巴细胞，打开下口，缓慢放流（1滴·min-1），收集于离心管中。

3）肝癌HSP70-肽复合物激活T淋巴细胞：于48孔板中加入T淋巴细胞（1×106反应细胞）和肝癌HSP70-肽复合物，置37℃。5%CO2环境中培养，予离心（1 000 r·min-1,10 min）后收集其上清液。

4）肝癌HSP70-肽复合物激活T淋巴细胞对肝癌细胞的体外杀伤作用：建立实验组（效应细胞为肝癌HSP70-肽复合物激活T淋巴细胞）和对照组（为未经激活的淋巴细胞），每组50份样本，并分别设立效应细胞和靶细胞平行对照孔，培养基调靶细胞浓度为1×104mL-1，效应细胞浓度为1×104mL-1，效靶之 50∶1,阴性对照孔只加 100 μL RPMI-1640 培养液，阳性对照孔中加100 μL 1 mol·L-1盐酸，每孔效靶细胞各 100 μL，总体积 200 μL，细胞混匀，37 ℃、5%CO2、饱和适度培养48 h，实验终止前4 h每孔加入新鲜配制的 5 mg·mL-1的 MTT 20 μL，离心（1 000 r·min-1）10 min，从每孔中吸出 150 μL 上清液，每孔加入分析纯MDSO 150 μL，震荡溶解5 min，于酶标仪上570 nm处读取OD值，按下列公式计算杀伤率：杀伤活性=上清液cpm×2/（细胞cpm+上清液cpm×2）×100%，cpm为每分钟放射性活性。

1.3 统计学方法

使用SPSS11.5统计软件。计量资料用x±s表示，各组间比较用两个样本的t检验，组内比较用单个样本的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

肝癌细胞经DEAE-52纤维素柱梯度洗脱分离后共有4个蛋白峰，各峰蛋白经电泳和考马斯亮蓝染色鉴定第一峰蛋白在相对分子质量70 000处有一深染的蛋白带，为此本研究得到了相对分子质量约为70 000的肝癌HSP70-肽复合物。

肝癌HSP70肽复合物激活T淋巴细胞（实验组）对肝癌细胞具有明显的杀伤力，未经肝癌HSP70-肽复合物激活的T淋巴细胞（对照组）对肝癌细胞几无杀伤力，2组比较差异有统计学意义（P＜0.01），且杀伤活性随着效靶比增加而增加（P＜0.05），见表1。

表1 2组肝癌细胞杀伤率比较 x±s,%

3 讨论

热休克蛋白（HSP）是高度保守的蛋白质。HSP根据其分子质量的大小分为HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族和小分子HSP 4个家族，各家族在正常的生理反应中低水平表达[2-3],然而，当机体受到紫外线照射、病毒感染、感染性休克、失血性休克、重金属中毒、细菌感染、放射性照射、寄生虫感染、细胞肿瘤恶化的病理和生理刺激情况下HSP的合成迅速增加。HSP70是HSP中最保守，含量最丰富的一类。HSP70在应激刺激及病理状态下生成最为显著，它作为分子伴侣与新结合的多肽链结合，并参与细胞内蛋白质的折叠，装配降解和修复过程，同时，HSP70具有与细胞内的蛋白质和多肽相互作用的功能，以维护蛋白的自稳系统，在细胞的信息传递、分化及获得性免疫反应中具有重要的调控作用，而且它又可作为一种内源性保护物质对机体损伤产生自身保护作用[4]。

有学者对MCA诱导的小鼠肉瘤HSP70的免疫作用进行了研究，发现被免疫鼠产生了抵抗相应HSP活细胞移植的能力，但正常组织来源的HSP不产生这种抗肿瘤移植的能力，而用灭活的自体肿瘤细胞诱导大鼠产生对同一肿瘤的移植排斥，说明HSP诱导的免疫也具有很强的特异性，仅对该肿瘤有作用，从而推测肿瘤细胞中存在肿瘤特异抗原，并在实验中证实小鼠肿瘤移植存在不同个体特异性肿瘤抗原及HSP70具有肿瘤免疫原性[5-6]。

HSP70-肽复合物在肿瘤免疫中的作用及机制及激活树突状细胞（DC）的抗肿瘤免疫有重要意义，DC是最强的抗原提呈细胞，HSP70有效地将肿瘤抗原肽传递给DC，从而达到高效应肿瘤抗原肽的作用，HSP70作为其免疫佐剂具有以下4个优点：1）用凝胶梯度洗脱法从肿瘤组织中制备的HSP70-肽复合物能结合多种肿瘤抗原，用它进行机体肿瘤免疫，不需要确定并分离肿瘤特异性抗原免疫符合物。激发机体产生抗肿瘤特异的激活T淋巴细胞效应，而且这种作用在同种间不受MHCI类分子限制，为肿瘤疫苗治疗提供了新的理论思路。2）肿瘤中提取的HSP70-肽复合物可活化多个T淋巴细胞，对所有肿瘤细胞均有杀伤的作用，避免了免疫逃逸和肿瘤的复发和转移。3）HSP70-肽复合物具有佐剂的功能，因此肿瘤的制备不需要佐剂。4）免疫HSP70-肽复合物可诱导树突状细胞，使机体产生记忆T细胞反应。HSP70-肽复合物在肾癌[7]和黑色素瘤[8]的免疫治疗中已取得了良好的效果。黄波等[9]的研究表明，H22肿瘤混合抗原肽经过HSP70提呈后能抑制肿瘤的生长，而且还可与其他因素配合产生良好的治疗效果。

本实验中，笔者利用肝癌组织提取HSP70-肽复合物，激活T淋巴细胞，并观察激活T淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤作用，结果显示肝癌HSP70-肽复合物激活T淋巴细胞对肝癌肿瘤细胞具有很强的杀伤作用。

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