不同发育阶段胎儿表皮干细胞差异表达基因的研究

蓝 蔚 ，彭 燕 ，刘德伍 ，纪雪亮 ，易先锋

（1.广东省工伤康复医院烧伤整形科，广州 510440；2.南昌大学第一附属医院烧伤中心，南昌 330006）

表皮干细胞是来源于胚胎外胚层皮肤组织的专能干细胞，是皮肤及其附属器发生、修复、改建的源泉。表皮干细胞的增殖分化机制十分复杂，受整合素、信号转导通路及细胞因子等众多因素的影响[1]。目前，对人表皮干细胞一些单个基因如P63、c-myc、K19等的表达特点及其影响因素研究已取得了一定的进展，已知它们在人体不同年龄阶段的表达存在差异[2-3]，但对人胎儿表皮干细胞基因的表达特点及其变化规律还不清楚。本研究采用基因芯片技术筛选早期胎儿与晚期胎儿表皮干细胞差异表达基因，从整体初步分析2个不同发育阶段人表皮干细胞基因表达变化的特征及其可能的生物学意义，为进一步寻找特异性发育调控基因提供线索，为表皮干细胞增殖分化特性的研究及其应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 标本来源

胎龄4～12周胎儿皮肤标本 （早期胎儿组）及28～32周胎儿皮肤标本（晚期胎儿组），来源于正常发育人工终止妊娠胎儿，由广东省工伤康复医院妇产科提供。每组10例。标本采集均得到患儿及家属知情同意，研究方案经医院医学伦理委员会批准。

1.2 表皮干细胞的分离培养

2组均采用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮，用Ⅳ型胶原快速黏附法分离、纯化胎儿表皮干细胞，以含表皮生长因子、角质细胞无血清培养液等组成胎儿表皮干细胞培养基进行体外培养[4]。每组10例细胞分离纯化后混合培养。

1.3 表达谱芯片的制备

芯片由北京博奥生物芯片有限公司提供，为人基因组寡核苷酸芯片（22 K），共有21 522条70 mer长度的Oligo DNA（每条Oligo DNA代表了人的一个基因），人类基因的Oligo库来自于Operon公司的 Human Genome Oligo Set Version 2.1。将此Oligo库用SmartArrayer点样仪点制在一张75 mm×25 mm经过化学修饰的载玻片上。为质控芯片制备和杂交的整个过程，点制在芯片上的样品还包括人的4个看家基因（H-ACTB、H-GAPD、H-LDHA、H-RPL9）作为阳性对照，以检测芯片数据的波动性。12条人工合成的与人基因没有同源性的70 mer Oligo DNA以及DNA点样液作为阴性对照。用来自酵母的8个与实验样品无关的核酸序列作为外参，Hex作为点样阳性对照，以避免受到实验RNA样品的干扰，检查芯片系统的有效性。

1.4 表皮干细胞RNA的提取

Trizol（Invitrogen,Gaithersburg,MD,USA）一步法提取细胞中的总RNA，通过异丙醇沉淀法浓缩RNA，并进一步采用NucleoSpin RNA clean-up试剂盒（MACHEREY-NAGEL，Germany）对总 RNA 进行过柱纯化，最后用分光光度计定量，甲醛变性胶电泳质检。

1.5 细胞RNA的荧光标记

以Total RNA起始，含有T7启动子序列的T7 Oligo（dT）Primer为引物，使用 CbcScript酶进行反转录合成cDNA。反转录产物用PCR NucleoSpinExtractⅡ Kit（MN）纯化。以 Random Primer为引物对反转录cDNA进行KLENOW酶标记，分别用Cy3-dCTP、Cy5-dCTP（GE Healthcare Cat.No.PA 55021/PA53021）标记Human对照组（以人类基因作为共同参照）和早期胎儿组，晚期胎儿组，标记产物用PCR NucleoSpinExtractⅡ Kit（MN）纯化，纯化后抽干。

1.6 杂交与清洗

标记的 DNA 溶于 80 μL杂交液中（3×SSC，0.2%SDS,5×Denhart’s,25%甲酰胺），于 42 ℃杂交过夜。杂交结束后，先在42℃左右含0.2%SDS，2×SSC的液体中洗 5 min，而后在0.2×SSC中室温洗5 min。玻片甩干后即可用于扫描。

1.7 芯片图像的采集与数据分析

芯片用LuxScan 10 KA双通道激光扫描仪（CapitalBio公司）进行扫描。采用LuxScan 3.0图像分析软件（CapitalBio公司）对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号；对芯片上的数据用Lowess方法进行归一化。根据cy5和cy3总体信号的平均值对各芯片进行片间线性校正，使得各张芯片的平均值相同；根据信号强度和图像质量对基因进行标记。判定基因有差异表达的标准为：表达差异值（Ratio值）=Cy5/Cy3比值＞2或＜0.5。

2 结果

2.1 表皮干细胞生物学特性观察

倒置相差显微镜下观察，体外培养的早期胎儿与晚期胎儿表皮干细胞形态相似，细胞克隆形成速度与克隆集落无明显差异。

2.2 总RNA抽提结果

提取的表皮干细胞总RNA在吸光度A260/280值≥1.8，甲醛变性凝胶电泳显示28 S、18 S条带亮度清晰、完整，质量合格，符合实验要求。

2.3 基因芯片扫描结果

在芯片操作过程中，Hex、外标、内标等阳性对照信号正常，阴性对照检测为阴性；看家基因重复性好，Ratio值CV不超过0.3，无影响数据的污染，从一方面证实实验数据的可靠性。晚期胎儿组与早期胎儿组样本相比，差异表达基因有805个，其中上调的基因有416个，下调的基因有389个。

2.4 差异基因表达分析

对结果在Molecule Annotation System进行了Pathway和Go的统计分析，差异基因涉及蛋白质翻译、能量合成和DNA复制，根据其表达蛋白的功能可将它们分为如下几类：1）核苷酸结合蛋白基因；2）蛋白质折叠结合相关基因；3）锌离子结合蛋白基因；4）ATP 结合蛋白基因；5）GTP 结合蛋白基因；6）序列特异性DNA结合蛋白基因；7）促分裂原活化蛋白激酶基因；8）核仁蛋白家族基因；9）癌基因与抑癌基因 ；10）核小体装配基因；11）其他类型基因。分子注释系统对差异表达基因的部分分类见表1。

晚期胎儿组与早期胎儿组相比，表达上调的基因主要为核苷酸结合蛋白基因、蛋白质折叠结合相关基因、锌离子结合蛋白基因和ATP结合蛋白基因等；表达下调的基因主要为GTP结合蛋白基因、序列特异性DNA结合蛋白基因、促分裂原活化蛋白激酶基因和核仁蛋白家族基因等。

表1 最显著差异表达基因的部分分类

3 讨论

在人体不同发育阶段，皮肤对于创伤的修复能力不同。在胎儿时期，人们可以观察到胎儿伤口的“无瘢痕愈合”。而表皮干细胞作为皮肤组织的专能干细胞，在皮肤发育成长过程中起着决定性的作用。目前对表皮干细胞一些单个基因的表达特点及其影响因素的研究已取得了一定的进展，但对人体生长发育过程中表皮干细胞的整体基因表达特点及其变化规律还不清楚。因此研究不同发育阶段人表皮干细胞基因表达谱的变化，对进一步探讨表皮干细胞的增殖分化机制、发展规律及其影响因素具有重要意义。

基因芯片是分子生物学实验技术的一个新突破，利用该技术可以对成千上万个基因的表达进行平行分析[5-7]。其基本原理是核酸分子杂交,即通过把大量的DNA片段以可寻址的方式,高密度地固定到一小块载玻片上,利用核酸碱基之间的配对,以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针,对样品DNA进行高效、并行的分析。基因芯片技术的突出特点是集成化、微型化及自动化，代表了未来分子诊断的发展趋势[8-10]。本研究采用基因芯片技术筛选早期胎儿与晚期胎儿表皮干细胞差异表达基因，通过分析二者之间基因表达的差异信息，来探索表皮干细胞的发育和增殖分化规律。研究结果显示：晚期胎儿与早期胎儿比较，胎儿表皮干细胞差异表达基因有805个，表明随着人的生长发育，表皮干细胞的基因表达发生了较大的改变，其在人胚胎发育不同时期所处的状态受到多种基因的表达调控。研究还发现，晚期胎儿与早期胎儿相比较表达上调的基因416个，主要有以下几类：1）核苷酸结合蛋白基因，如DYNC1H1，PRKCI。DYNC1H1属于动力蛋白，它参与微管为基础的运动及有丝分裂纺锤体组织和生物发生。PRKCI[11]为蛋白激酶 Ci，它参与蛋白定向膜、细胞骨架组织和生物发生，以及确立和（或）维持表皮细胞极性及细胞间连接组装和维持。2）蛋白质折叠结合相关基因，如HSPE1。HSPE1参与蛋白质的折叠与伸展及多聚复合体的组装。3）锌离子结合蛋白基因。4）ATP结合蛋白基因。上调基因主要为细胞骨架结构蛋白基因。细胞骨架[12]是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。细胞骨架不仅在维持细胞形态和保持细胞内部结构的有序性中起着重要作用，而且与细胞的胞质运动、物质运输、能量转换、信息传递、基因表达、分裂和分化等生命活动密切相关。晚期胎儿组与早期胎儿组比较，表达下调的基因389个，主要有以下几类：1）GTP结合蛋白基因，如EFTUD2，为含延伸因子Tu GTP结合域2，它参与核mRNA剪接、蛋白生物合成及RNA剪接。2）序列特异性DNA结合蛋白基因，如FOSL2，ELF4。FOSL2属于转录因子AP-1家族，它对细胞因子、生长因子、感染或致癌刺激等生理或病理信号发生应答，调节基因的转录，参与细胞的增殖、分化等过程。ELF4为E74样因子4，它参与细胞增殖，正调控转录自RNA聚合酶Ⅱ启动子，调控转录[13]。 3）促分裂原活化蛋白激酶基因（MAPK），MAPK3、MAPK13、DUSP1 和 DUSP2。 DUSP1[14]和DUSP2参与蛋白氨基酸去磷酸化，抑制MAPK，促使细胞分化。MAPK3[15]和 MAPK13参与调控细胞周期及蛋白氨基酸磷酸化。4）核仁蛋白家族基因，NOLA2和NOLC1均参与rRNA加工，调控细胞周期和有丝分裂。表达下调的基因主要集中在与细胞增殖分化相关的功能基因。

通过本实验结果分析，晚期胎儿相对于早期胎儿表皮干细胞，一些与细胞成熟相关的细胞骨架结构蛋白基因上调，而如GTP结合蛋白基因、序列特异性DNA结合蛋白基因、MAKP活性蛋白基因等一些与细胞增殖分化相关基因下调。表明，随着胚胎的发育，表皮干细胞在维持细胞形态和保持细胞内部结构特性以及细胞稳态的维持上更加成熟，而其增殖分化的能力可能呈现下降趋势。另从本实验结果看,基因表达谱的变化与临床上关于创伤修复的研究结论有较好一致性，说明所采用的基因芯片技术是可靠的。通过对这一同种基因纵向的比较，筛选差异表达基因，及在分子水平对相关基因群的进一步研究，有助于使研究者获得对表皮干细胞的新认识和新结论。

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