高效液相色谱法测定七叶莲中延胡索酸的含量

涂 琼，卢庆红

（江西省儿童医院药剂科，南昌 330006）

七叶莲又名七角枫，是五加科大参属植物，在我国西南部和长江中下游的广大地区均有分布。七叶莲全草入药，有驱热散风、解毒消肿、散瘀接骨之功效，常用于治疗骨折、风湿性关节炎、跌打损伤等各种疾病，尤其应用于类风湿性关节炎的治疗取得了很好的效果[1]。近几年，从七叶莲的挥发油中分离了倍半萜烯类化合物并证明其具有抗肿瘤作用[2]，在七叶莲的其他提取物中分离了三萜皂苷类化合物和有机酸。其有机酸主要成分之一为延胡索酸[3]，与琥珀酸、γ-羟基丁酸共同配制的三丁酸钠注射液，热板法镇痛实验具有显著镇痛作用。为有效反映七叶莲药材质量，笔者参考有关文献[4-5]，建立高效液相色谱法测定七叶莲药材中延胡索酸的含量，以期为七叶莲药材质量提供实验基础。

1 仪器与试药

LC-10ATvp、岛津SPD-10Avp高效液相色谱仪。HHS 21-4B型号电热恒温水浴锅（上海医疗机械五厂），延胡索酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：1541-200001），七叶莲药材于2008年3月采自江西省宜丰县山区，由江西中医学院中药鉴定室赖学文副教授鉴定为五加科大参属植物短梗大M.rosthornii，并粉碎成细粉备用。乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（5∶95）；检测波长：210 nm，流速 1.0 mL·min-1；进样量 5 μL；柱温：35 ℃。在上述色谱条件下，供试品溶液中延胡索酸与其他成分能达到基线分离，与相邻色谱峰的分离度大于1.5，见图 1。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取延胡索酸对照品适量，加甲醇溶解制成每毫升含1.024 mg的延胡索酸溶液，作对照品储备液，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备

取本品粉末（过 1号筛）约2 g，精密称定，加70%乙醇200 mL回流提取2 h，提取液滤过，至水浴蒸干，残渣加石油醚10 mL浸泡2次，每次5 min，弃去石油醚液，蒸干，残渣用甲醇溶解，移置50 mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.3 线性关系考察

精密量取延胡索酸对照品溶液 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、2、3 mL，置 5 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取5 μL，注入液相色谱仪中，测定延胡索酸峰面积。以进样量（C）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程：Y=24 365C-272.104，r=0.999 5。结果显示，延胡索酸的检测浓度在0.102 4～3.067 2 μg范围内线性关系良好。

2.4 精密度试验

取浓度为0.102 4 mg·mL-1的延胡索酸对照品溶液，精密吸取5 μL，在上述色谱条件下,连续测定5次，结果测得延胡索酸峰面积分别为226 770、216 549、218 967、223 675、221 250，RSD 为 1.79%，表明精密度良好。

2.5 稳定性试验

取同一供试品溶液，精密吸取供试品溶液5 μL，在 0、2、4、6、8 h 分别按上述色谱条件进样测定，结果测得延胡索酸峰面积分别为95 112、95 526、95 091、95 040、95 707，平均峰面积 95 295，RSD 为0.32%，表明样品在8 h内稳定，本方法稳定性良好。

2.6 重复性试验

取同一七叶莲药材5份，按“2.2.2”项中方法制备样品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，并计算含量。结果5份样品延胡索酸含量的RSD为0.61，符合重复性要求。

2.7 加样回收试验

取已知延胡索酸含量的七叶莲药材1 g，9份，精密称定。各样品分别加入延胡索酸对照品贮备液适量，按“2.2.2”项下方法平行制备。按“2.1”项下色谱条件测定。结果延胡索酸的平均回收率为99.05%，RSD为0.55%。结果见表1。

表1 回收率实验结果

2.8 样品测定

取七叶莲5批样品，经干燥、粉碎后分别按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，精密吸取延胡索酸对照品溶液和供试品溶液各 5 μL，按“2.1”项下色谱条件，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算延胡索酸的含量。结果显示，5批样品中延胡索酸含量分别为0.480%、0.485%、0.478%、0.493%、0.465%。

3 讨论

1）波长的选择:将适量浓度的延胡索酸对照品溶液用紫外分光光度仪在波长200～400 nm范围内进行扫描，结果延胡索酸在210 nm处有最大吸收。

2）提取溶剂的选择:曾用 95%、80%、70%、60%乙醇作为溶剂进行提取，结果发现70%乙醇提取效果相对较高，故选用70%乙醇作为提取溶剂。

3）流动相的选择：曾用甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液（5∶95）、甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液（10∶90）、乙腈-0.4% 磷酸二氢钾（20∶80）、乙腈-0.1%磷酸溶液（5∶95）作为溶剂系统。结果表明，乙腈-0.1%磷酸溶液（5∶95）系统的分离效果最好。

采用HPLC法测定七叶莲药材中的延胡索酸含量，简便、准确、精密度好，平均加样回收率为99.05%，为更好地控制七叶莲药材的质量提供了可靠的方法。

[1] 周菲菲，朱湘生.七叶莲酒治疗类风湿性关节炎临床观察[J].中国农村医学，1998，6（5）：44.

[2] 何涛，李林松，康丽洁，等.七叶莲挥发油成分的GC/MS分析[J].江西中医学院学报，2006，18（4）:51.

[3] 崔向青，蒋燕，杨辉.七叶莲的研究进展[J].中华中医学杂志，2005，20（增刊）：308-309.

[4] 廖建春.高效液相色谱法测定七叶莲胶囊中延胡索酸的含量[J].药学与临床研究，2007,15（5）:421-422.

[5] 刘佳，朴惠顺，施溯筠，等.HPLC法测定金顶侧耳中延胡索酸的含量[J].中国药房，2010,21（11）:1018-1019.