SHH信号通路在血管平滑肌细胞增殖和凋亡中的作用

孙爱萍 程晓曙

(南昌大学第二附属医院，江西 南昌 330006)

血管平滑肌细胞(VSMC)的异常增殖是包括动脉粥样硬化在内的血管增殖性疾病的共同病理基础〔1〕。动脉粥样硬化有着较高的致病率和致死率，是一类严重威胁人类健康的疾病〔2〕。动脉粥样硬化的病理变化包括脂质聚集、单核-巨噬细胞的侵入、泡沫细胞形成、炎症及 VSMC增生等〔3〕。其中，VSMC的过度增殖被认为是促进动脉粥样硬化发生发展的一个关键因素。国外有研究表明，Hedgehog(HH)信号通路的激活可促进创伤后微血管内皮细胞的增殖和抑制其凋亡，有利于损伤毛细血管的修复〔4〕。国内研究显示，SHH通路启动因子重组SHH可促进海水浸泡血管内皮细胞增殖和抑制其凋亡，证实SHH信号通路通过作用于血管内皮细胞而促进毛细血管的修复〔5〕。本研究通过体外培养VSMC，并采用SHH信号通路特异抑制剂环巴胺(Cyclopamine)进行干预，研究SHH信号通路在VSMC增殖中的作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人脐动脉VSMC株，由中国科学院细胞中心提供;DMEM培养基、胎牛血清，由美国Hyclone公司提供;Cyclopamine，由美国Biomol公司提供;二甲基亚砜(DMSO)，由美国Sigma公司提供;四甲基偶氮唑蓝(MTT)、碘化丙啶(PI)，由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。ELITEESP型流式细胞仪，由美国Coulter公司提供;Multicycle分析软件，由美国Phoenix公司提供。

1.2 VSMC的培养 将VSMC接种在含10%胎牛血清、双抗(100 U/ml青霉素和100 g/ml链霉素)的高糖DMEM培养液中，然后于37℃、饱和空气湿度和5%CO2条件下在孵箱内进行培养。经0.25%胰酶+0.2%乙二胺四乙酸(EDTA)消化传代，3 d传1代，实验用第4～5代细胞。

1.3 MTT方法测定细胞增殖 传代细胞融合生长至80%左右时经消化后调整细胞悬液浓度至5×104/ml，接种于96孔板，每孔加200μl悬液。各培养孔加入Cyclopamine，终浓度分别为0.625、1.25和2.5μmol/L。以酒精(Cyclopamine的溶媒)作为空白对照，终浓度为0.1%。上述细胞分别培养12、24 h和48 h时，每孔加入5 mg/ml MTT 20μl。继续培养4 h后加入DMSO显色。最后用酶标仪检测各孔吸光度(A值)。每孔设定5个复孔，取其均值作为最终测量值。细胞增殖抑制率(%)=1-δA 值实验孔/× δA 值对照孔100%。

1.4 流式细胞术检测细胞周期和凋亡 按MTT实验操作，各培养孔加入Cyclopamine，终浓度分别为1.25和2.5μmol/L，培养24 h和48 h。消化收集各组细胞，并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，用4℃无水乙醇固定30 min，离心，染色30 min后采用流式细胞检测仪检测细胞周期，检测结果经Multicycle软件分析。凋亡指数(AI)=亚二倍峰细胞数/总细胞数×100%，增殖指数(PI)=(S期 +G2/M期)(G0/G1期 +S期 +G2/M期)×100%。

1.5 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料以x±s表示。

2 结果

2.1 Cyclopamine对增殖指数和AI的影响 在培养液中加入不同浓度Cyclopamine后，VSMCPI降低，AI升高。见表1。

表1 Cyclopamine对增殖指数和AI的影响(x±s)

2.2 Cyclopamine对细胞增殖的影响 在培养液中加入不同浓度Cyclopamine后，平滑肌细胞的增殖均受到抑制，并且抑制作用呈浓度及时间依赖性。见表2。

2.3 Cyclopamine对细胞周期的影响 在培养液中加入不同浓度Cyclopamine后，VSMC中处于G0/G1期的比例升高，而处于S期和G2/M期的比例降低。见表3。

表2 Cyclopamine对细胞增殖的影响(x±s)

3 讨论

目前对动脉粥样硬化发病原因尚未完全确定，可能与年龄、性别、血脂异常、高血压、吸烟、糖尿病、肥胖、感染等因素有关〔6〕。近年来的观点认为动脉粥样硬化是一种炎症性疾病，VSMC过度增殖被认为是促进动脉粥样硬化发生发展的一个关键因素〔7，8〕。阐明血管平滑肌在病理性刺激中的增殖机制，对减缓动脉粥样硬化的进程，预防和治疗动脉粥样硬化的发生发展可能起到积极的作用。

HH基因编码一系列分泌型信号蛋白，在胚胎的发育过程中起着调控细胞增殖及组织分化的作用，在成熟器官中HH信号通路处于失活状态。近年来研究发现，HH信号通路参与多种损伤后的组织修复过程，包括四肢、血管、前列腺、神经、胆管、肺以及骨骼〔4〕。但是，HH信号在不同组织中所起的作用是不一致的，认为HH信号的调节作用可能由于种属、体内、体外以及环境的不同而有所不同〔9〕。此外，研究显示，HH信号系统与多种疾病的发生、发展相关，在器官形态发育、调节细胞增殖中起重要的作用〔10〕。SHH信号通路在人类根据配体的不同分为3个亚型，即SHH信号通路、Indian hedgehog(IHH)信号通路及Desert hedgehog(DHH)信号通路〔11〕。该信号途径是由SHH、2个跨膜受体Patched(Ptc)和Smoothed(Smo)组成的受体复合物、蛋白激酶A以及下游转录因子Gli家族(Glil、Gli2、Gli3)等组成，在进化上高度保守〔12〕。SHH信号通路在胚胎发育中的细胞生长分化、组织器官形成及成体干细胞的维持等方面具有重要的作用。已有研究发现，SHH信号通路参与调控VSMC和内皮细胞的分化，诱导肺血管形成，从而促进肺的发育成熟和器官形成〔13〕。此外，SHH通路启动因子重组SHH可促进海水浸泡血管内皮细胞增殖和抑制其凋亡，证实SHH信号通路通过作用血管内皮细胞而促进毛细血管的修复〔14〕。

Cyclopamine是从藜芦属植物内分离得到的一种异甾体类生物碱，通过对抗SHH信号通路中Smoothed(Smo)蛋白而特异性抑制 SHH信号通路〔15〕。MTT结果显示，培养液中加入0.625、1.25和2.5μmol/L Cyclopamine后血管平滑肌增殖受到明显抑制，Cyclopamine对血管平滑肌增殖的抑制作用呈浓度及时间依赖性。因此，SHH信号通路在血管平滑肌增殖过程中起着一定作用。流式细胞仪检测结果显示，在培养液中加入1.25和2.5μmol/L Cyclopamine后，VSMC中处于G0/G1期的比例升高，而处于S期和G2/M期的比例降低，从而导致PI降低和AI升高。因此，SHH信号通路在VSMC增殖和凋亡中发挥重要作用，但是其确切的机制尚需作进一步研究。

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14 杨 昱，钱桂生，王关嵩，等.重组Shh因子对海水浸泡肺微血管内皮细胞增殖和凋亡的影响研究〔J〕.第三军医大学学报，2009;31(13):1268-71.

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