黄连解毒汤对自发性糖尿病大鼠免疫炎症因子及损伤的影响

姜 萍，李 晓

(山东中医药大学附院内科，济南 250011)

自发性糖尿病大鼠(Goto-Kakizaki diabetes prone rat，GK大鼠)是研究糖尿病的较好模型，比目前常用的链脲霉素模型更能符合人类2型糖尿病特点。在糖尿病心肌病变发展过程中，研究显示炎症因子可造成微血管及心肌的损伤［1］，从中医病因病机学说可概括归纳为糖毒蕴结、热毒耗伤心络心体。黄连解毒汤是清热解毒的代表方剂，本实验采用GK大鼠主要观察黄连解毒汤对自发性糖尿病大鼠心肌炎症因子的影响及对心肌损伤的防治作用，为防治糖尿病心肌病变提供新思路和证据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

GK3月龄雄性大鼠30只(中国科学院上海实验动物中心，批号0005569)，体质量210～300g，随机分为黄连解毒汤组、二甲双胍组、GK对照组3组。另取普通级4月龄雄性Wister大鼠10只作为正常对照组，体质量330～410g(山东大学新药评价中心提供，动物合格证号200203)。

1.2 药品及试剂

实验用药:按照黄连解毒汤原方比例制备水煎剂，浓缩至1g生药/ml(山东中医药大学附属医院制剂室完成)，将二甲双胍等配制成合适的悬浊液。

试剂:核因子-κB(goat anti Nuclear factor-κB，NF-κB);酶联免疫试剂盒(美国adlitteram diagnostic laboratories INC，ADL CD A-011，LOT RT110371);细胞间黏附分子(sICAM-1)酶联免疫试剂盒(美国R＆D Systems Inc，Cat No:SXR060 Lot No.0701120，中国尚柏公司代理);白介素-1(IL-1)酶联免疫试剂盒(美国R＆D Systems Inc，Cat No:SXR019 Lot No.:0701119);Sun Biomedical Technology Co.，Ltd 中国尚柏公司代理);肿瘤坏死因子(TNF-α)放射免疫试剂盒;内皮素(ET-1)放射免疫试剂盒(北京普尔伟业生物科技有限公司，原北京东亚免疫技术研究所)。主要实验仪器:匀浆机(IKA-ULTRA-TURRAX T 25basic);ELx808酶标仪(美国 BIO-TEK INSTRUMENTS，INC);GMJ型全自动放射免疫γ计数器(江苏省医疗电子研究所);DDL-5冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)。

2 方法

2.1 分组用药

给药剂量相当于人口服10倍量。各组按以下方式饲养及灌胃给药12周。各组给予正常饲料喂养的同时分组给药，黄连解毒汤组给予水煎剂9.0g/kg·d，西药组给予二甲双胍0.125g/kg·d，正常对照组和GK对照组分别给予生理盐水2mL/kg·d。

2.2 标本处理及制作

按上述方法灌胃12周，因动物灌胃等死亡，黄连解毒汤组9只，其他组均为8只。禁食不禁水12h，以上动物行氯胺酮腹腔麻醉、解剖，腹主静脉取血，采用强生公司One Touch Profile血糖仪测定血糖。取心脏立即用预冷的生理盐水冲洗，冲洗后在冰上操作，沿左心室方向解剖。用4%多聚甲醛固定，连续做病理切片，片厚5um，行HE染色。取新鲜心肌组织，每克心肌组织加5ml生理盐水置匀浆机上10000r/min 10s×3次，制备20%心肌组织匀浆，4000r/min离心10min，取上清液4℃保存待测。

2.3 观察项目及检测方法

NF-κB、sICAM-1、IL-1 采用酶标双抗体夹心法测定。根据曲线方程计算各样品NF-κB、sICAM-1、IL-1浓度。TNF-α、ET-1采用放免法测定，由仪器自动计算各样品含量。取各组心肌HE染色切片光镜下观察。

2.4 统计学处理

所有数据均由SPSS统计软件包统计处理。各组均数以均值±标准差(±s)表示，各组数据均进行方差齐性检验后采用方差分析，均值间两两比较用t检验。

3 结果

3.1 各组动物血糖及心肌匀浆炎症因子含量

表1显示，计算各组动物血糖及心肌匀浆NF-κB、sICAM-1、IL-1、TNF-α、ET-1 等炎症因子含量。

表1 各组大鼠血糖及心肌匀浆炎症因子比较(±s)

表1 各组大鼠血糖及心肌匀浆炎症因子比较(±s)

组 别 例数 血糖(mmol/L)NF-κB(ng/ml)sICAM-1(ng/ml)TNF-α(pg/ml)IL-1(pg/ml)ET-1(pg/ml)正 常 大 鼠 8 4.27±0.88 236.20± 53.70 306.20± 58.60 350.60±31.30 53.62±11.00 48.10± 3.70 GK 对 照 8 8.72±0.73★★ 609.80± 49.40★★ 501.90± 75.70★★ 833.12±31.60★★ 96.77±31.35★★ 160.00± 7.28★★二 甲 双 胍 8 6.14±0.90＊＊ 601.03±154.90 422.98±129.27 776.25±15.90＊＊ 75.78±11.50* 141.67±28.70黄连解毒汤组 9 5.70±0.74＊＊ 533.73± 65.90＊＊△ 392.78± 66.20＊＊ 602.70±40.30＊＊△△ 55.93±12.80＊△△ 105.35± 7.10＊＊△△

注:GK对照组与正常大鼠组比较:★P＜0.05，★★P＜0.01;各组与GK对照比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;中药组与二甲双胍组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01

表1显示，与正常对照组比较，GK对照组血糖明显升高，黄连解毒汤组、二甲双胍组血糖均下降，差异有非常显著统计学意义(P＜0.01)，2药物组之间差异无统计学意义。

与正常对照组比较，GK对照组各炎症因子明显升高(P＜0.01)。与GK对照组比较，二甲双胍组IL-1、TNF-α下降(P＜0.05)，黄连解毒汤组各炎症因子明显降低(P＜0.05)，黄连解毒汤与二甲双胍比较，各炎症因子下降程度较大，其中 NF-κB、TNF-α、ET-1差异有统计学意义(P＜0.05)。

综上分析，黄连解毒汤和二甲双胍能均能显著降低血糖，但在降低炎症因子方面，黄连解毒汤优于二甲双胍。

3.2 切片镜下观察所见

正常大鼠可见心肌纤维清晰，心肌排列规则，未见变性坏死和炎细胞浸润(见图1)。GK对照组可见部分心肌纤维呈灶性肥大，并见较多细小空泡，心肌细胞变大变宽，核偏向一侧，部分心肌纤维横纹消失，部分心肌呈蜂窝状仅存肌膜，心肌间质纤维结缔组织增生(见图2)。二甲双胍组部分心肌纤维呈灶性肥大，心肌细胞变大变宽，核偏向一侧，程度有所减轻，部分心肌间质纤维结缔组织增生(见图3)。黄连解毒汤组病变的心肌纤维程度明显减轻，仅见个别心肌细胞肥大，核偏位(见图4)。

4 讨论

黄连解毒汤收载于唐·王焘所著的《外台秘要》，由黄连、黄芩、黄柏、栀子4味中药组成，具有泻火解毒之功效，是清热解毒的代表方。既往研究证明，黄连解毒汤有抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂之功效，可多靶点改善胰岛素抵抗等［2］，其抗炎作用与抑制IL-1、TNF-α等炎症因子表达、抑制中性粒细胞与血管内皮黏附有关［3］。近年来研究表明，黄连解毒汤可提高2型糖尿病脂肪和肌肉组织中葡萄糖转运子4的蛋白表达及转位［4］，可降低2型糖尿病大鼠血清中白介素1、4、6、10、肿瘤坏死因子、C 反应蛋白的水平［5，6］。

糖尿病早期即可出现微血管内皮功能损伤和血管活性物质分泌异常［7］，目前对糖尿病心肌及微血管病变的确切发病机理尚未完全阐明，涉及糖基化终产物(AGEs)形成、多元醇通路活跃、氧化应激增加、己糖通路活跃、蛋白激酶 C(PKC)激活等等［8，9］。在上述多种机制中，高血糖可增强氧化应激，氧化应激可激活几乎所有已知的有关信号传导通道，通过激活核因子-κB(NF-κB)上调黏附分子及炎性因子基因转录［10］。糖基化终产物(AGEs)也可激活蛋白激酶通路及 NF-κB 信号通路［11］。

图1 正常对照组(HE染色×200倍)

图2 GK对照组(HE染色×200倍)

NF-κB能引起一系列参与炎症和免疫反应基因的表达增加，如 TNF-α、IL-1、sICAM-1、ET-1、血管细胞黏附分子、选择素等，反过来，TNF-α和IL-1又能激活NF-κB，NF-κB 起着中心调控作用［12］。多种免疫应答、炎症反应、细胞黏附等有关的细胞因子作用于微血管内皮细胞或血细胞，导致局部炎症、微循环障碍的发生，随着病程延长，微血管、心肌损伤、心肌纤维化，最终导致糖尿病心肌病变。因此，糖尿病心肌病变是一种轻度的亚急性或慢性炎症性病变［13］。

糖尿病属中医学“消渴”范畴，一般认为其病机为“阴虚燥热”，我们认为糖尿病心肌病变的中医基本病机为燥热郁久、糖毒蕴结、火化为毒、热毒内蕴、耗伤心络心体。糖尿病心肌损伤的病理生理机制比较复杂，目前尚未完全阐明，炎症损伤是其病理过程之一。本文对炎症损伤过程进行中医理论探索，认为既是病理产物又是致病因素的炎症因子符合中医学“内生之毒”的性质，高血糖及炎症过程导致心肌损伤的病理机制与中医学的“热毒伤络、心体失养”有非常密切的相关性。我们既往的临床及实验研究［14～17］显示，以清热解毒为治法的心和颗粒剂调心饮，对不稳定心绞痛有确切疗效，可降低患者、高脂血症大鼠模型、动脉粥样硬化家兔模型中有关炎症因子含量及抑制心肌组织中NF-κB的表达等作用。

目前尚未见黄连解毒汤针对糖尿病心肌炎症损伤的报道。有学者认为，毒邪内蕴是导致糖尿病等代谢性疾病的重要原因之一，与炎症有关的转录因子NF-κB信号通路对上述疾病发生和发展具有关键的调控作用，黄连解毒汤对上述疾病的治疗作用，可能源于对多种细胞因子的调节作用，由此认为对阐明黄连解毒汤的异病同治原理具有意义［18］。鉴于糖尿病的慢性炎症病理特点，我们探讨黄连解毒汤对糖尿病心肌病变的防治作用。

本实验检测自发性糖尿病大鼠心肌匀浆中有关炎症因子含量。从实验结果分析，二甲双胍能显著降低IL-1、TNF-α，其原因可能与降低血糖有关。黄连解毒汤也能降低血糖，并能够显著降低NF-κB、sICAM-1、IL-1、TNF-α、ET-1 等，并在降低 NF-κB、TNF-α、ET-1方面优于二甲双胍，显示了抗炎的独特作用。病理切片显示，能显著减轻心肌损伤。

本实验进一步证明了黄连解毒汤能够降低心肌匀浆中炎症因子含量，可防治心肌炎症损伤，为糖尿病心肌病变的治疗提供了新证据。

图3 二甲双胍组(HE染色×200倍)

图4 黄连解毒汤组(HE染色×200倍)

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