鼠平台骨折术后活血补肾药物对软骨退变相关因子的影响

林梓凌，曾建春，樊粤光，黄永明，孙鸿涛，曾意荣，赵京涛

(广州中医药大学第一附属医院骨科，广州 510405)

创伤性骨关节炎是骨性关节炎的一种类型［1］，由骨关节创伤骨折后等原因引起。为探讨运用中医活血补肾方药，能否有效影响关节骨折术后的软骨损害病变相关因子，抑制软骨退变，我们通过动物实验进行了以下观察研究。

1 实验与用药

1.1 实验准备

选择成年雌性SD大鼠40只(广州中医药大学动物实验中心提供)，体质量约0.35 ～0.45 kg，随机分成正常组、中药观察组、对照观察组和空白组，每组10只。

1.2 动物造模

除空白组外均进行双侧造模。以质量分数2.5% 的硫贲妥钠(2 ml/kg体质量)腹腔内注射麻醉，术区消毒后，无菌状态下于胫骨结节外侧切开显露胫骨近端，以微型骨凿纵行劈开胫骨平台外侧髁。复位后，自大鼠胫骨平台外侧插入一枚事先消毒好直径0.8mm的克氏针，平行关节面横穿胫骨平台，针尾弯曲埋于平台皮下。术后不限制活动，10万级无菌动物实验室分笼饲养，动物饲养室温度为20±1℃，湿度为55±2%。

1.3 药物准备

中药观察组给予活血补肾方(关节康组方加减)［2］汤剂口服(广州中医药大学第一附属医院煎药室提供)。原方由熟地、川牛膝、杜仲、丹参、川芎、独活、红花、木瓜、木香、补骨脂等药物组成［2］。前5d加桃仁、赤芍、当归，原方熟地改为生地，5d后原方加骨碎补、枸杞子。

对照观察组给予口服西乐葆，每日1次。空白组给予生理盐水，每日1次。所有药物均按体表面积折算动物的等效剂量，再用生理盐水配成每天4ml溶液灌胃。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 标本采集 分别于术后3d、7d及21d大鼠眼角取血，离心后取上清液置－70℃保存待测。

1.4.2 TNF-а水平及MMP-3浓度检测 采用双抗体夹心ELISA法，实验步骤按试剂盒说明书进行。

1.4.3 NO测定 用硝酸还原酶法，测定方法参照试剂盒内说明书进行。

1.4.4 统计学方法 采用 SPSS 13.0软件进行统计学处理，组间均数比较行t检验，P＜0.05为有统计学意义，用双变量相关分析法分析患者与血清中MMP-3、TNF-а之间的关系。

2 结果

2.1 大鼠血清中TNF-а、MMP-3水平检测结果

表1、2显示，3d中药观察组、空白组及对照观察组血清TNF-а、MMP-3水平显著高于空白组(P＜0.01)。中药观察组、空白组及对照观察组3d、7d和21dTNF-а水平有逐渐升高趋势，两两比较差异有统计学意义(P＜0.01);空白组3d、7d和21d MMP-3水平同样呈逐渐升高趋势，两两比较差异有统计学意义(P＜0.01);但是中药观察组和对照观察组MMP-3的3d和7d TNF-а水平虽然也有升高趋势，两两比较差异无统计学意义 (P＞0.05)，而7d和21d则差异有统计学意义(P＜0.01)。同时在7d和21d的对比中，空白组血清TNF-а、MMP-3水平显著高于中药观察组 (P＜0.01)。而对照观察组在7d时与中药观察组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，与空白组比较差异明显(P＜0.01);反之，21d时对照观察组与中药观察组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，与空白组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。

2.2 大鼠血清NO浓度检测结果

表3显示，3d中药观察组、空白组及对照观察组血清NO浓度水平显著高于空白组 (P＜0.05)。空白组3d、7d和21dNO浓度同样呈逐渐升高趋势，两两比较差异有统计学意义 (P＜0.05);但是中药观察组和对照观察组NO浓度的3d和7d虽然也有升高趋势，但两两比较差异无统计学意义 (P＞0.05)，而7d和21d差异则有统计学意义(P＜0.05)。同时在7d和21d的比较中，空白组血清NO浓度显著高于中药观察组 (P＜0.05)，而对照观察组在7d时与中药观察组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，与空白组比较差异明显(P＜0.05);反之，21d时对照观察组与中药观察组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，与空白组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。

表1 血清TNF-а水平比较(pg/ml)

表2 血清MMP-3水平比较(ng/ml)

表3 大鼠血清中NO浓度比较

3 讨论

高能量损伤骨折致关节软骨的破坏及退变，是创伤性关节炎的主要病理变化。

胫骨平台骨折属中医“骨折”范畴，而内固定术后创伤性关节炎的产生、功能障碍可归属痹证等范畴。骨折外伤，脉络受阻，气滞则痛，血瘀则肿，致使气滞血瘀、气血不通、荣养不利则关节屈伸不灵，活动受限。骨折恢复期肝肾气血主之，肝肾亏虚、筋骨失养则恢复缓慢，失荣则痛，所谓“膝痛无有不因肝肾虚者”也，因此气血瘀阻、肝肾亏虚乃是平台骨折术后关节软骨修复愈合阶段的主要表现。

应用活血补肾方药治疗骨关节炎相关研究证实［3］，软骨退变有良好的防治作用。如活血药当归、川芎和丹参能有效降低骨性关节炎中炎症因子水平，保护和促进软骨细胞修复，防治关节软骨退变［4～8］。应用活血补肾方药在动物实验中证明有一定的镇痛作用，能减轻药物损伤所致大鼠足跖肿胀的作用及部分抗炎功效［9］。

在补肾药物方面，汪青春等［10，11］发现补肾方药对延缓软骨降解效果较好，可增强SOD的活性，降低血清HA水平，抑制软骨GAG的降解，轻度下调关节软骨IL-、iNOS的基因表达，对IL-6有轻度上调作用;且能增加软骨细胞功能，对受破坏的软骨修复似有一定作用。曾意荣等认为［12］，活血补肾复方中药能显著降低膝骨关节炎患者血清MMP-3的水平，间接预防II型胶原总量丢失，显著降低膝骨关节炎患者血清IL-1水平，显著降低膝骨关节炎患者血清透明质酸水平，显著提高超氧化物歧化酶活性，降低乳过氧化物酶活性，清除氧自由基。

通过我们的动物实验可见，关节骨折术后早期，运用活血补肾方药的中药观察组血清MMP-3水平显著低于对照组，可以认为活血补肾方药能在治疗早期便有效抑制MMP-3水平的增高。而在中期，中药观察组血清TNF-а、MMP-3和NO的水平均显著低于对照组，说明应用活血补肾法的中药观察组对这期间相关检测因子指标的水平增长能有效抑制。TNF-a、MMP-3和NO等因子都是关节软骨损害过程中重要的诱发、介导因子，它们在血清和关节液中的浓度水平高低，可反映关节软骨退变发生、发展的进程。因此，根据动物实验室检验结果发现，中药观察组对关节骨折固定术后的血清TNF-a、MMP-3和NO水平增长能有效抑制，证明运用活血补肾方药辨证施治用药，能有效防治关节骨折术后软骨退变进程。

综上研究所示，辨证应用活血补肾药物对于抑制胫骨平台骨折术后关节软骨退变进程的相关因子水平，防治创伤性关节炎的发生发展产生了积极有利的影响。

［1］ 许学猛，王羽丰，邓晋丰，等.活血补肾胶囊影响兔膝关节退行性疾病骨内高压变化的实验研究［J］.中国中医骨伤科杂志，2001，9(4):24-26.

［2］ 周斌，樊粤光，曾意荣.中药关节康治疗膝骨性关节炎的临床研究［J］.广州中医药大学学报，2006，23(6):476-480.

［3］ 许学猛，王羽丰，邓晋丰，等.活血补肾胶囊影响兔膝关节退行性疾病骨内高压变化的实验研究［J］.中国中医骨伤科杂志，2001，9(4):24-26.

［4］ 王文璜，刘宏泽，卫小春，等.川芎嗪防治膝关节软骨退变的实验研究［J］.中国骨伤，2004，17(2):80-83.

［5］ 晏雪生，彭亚琴，明安萍.川芎嗪注射液对体外培养软骨细胞影响的实验研究［J］.中国中医骨伤科杂志，2002，10(1):51-54.

［6］ 吕红斌，岳珍，王嘉美，等.四种中药对体外培养兔关节软骨细胞代谢的影响［J］.中国运动医学杂志，1995，14(3):135-138.

［7］ 王耶，刘建宇，宋艳，等.丹参和透明质酸钠注射液对骨性关节炎治疗作用的实验研究［J］.中国生化药物杂志，1998，19(5):248-251.

［8］ 王秀华，刘元禄，苏姿兵，等.丹参关节内注射对兔膝骨关节炎细胞因子 IL-I及 TNF的影响［J］.中医正骨，2003，15(10):1-4.

［9］ 王丽新，邹衍衍，樊粤光.关节康片的抗炎镇痛作用及毒性观察［J］.中药新药与临床药理，2005，16(6):417-420.

［10］ 汪青春，董蕙芳，沈墙芝，等.中药对膝骨关节炎黑鼠血清SOD、HA、NO 水平的影响［J］.中医正骨，1999，11(5):6-8.

［11］ 汪青春，石印玉，沈墙芝，等.中药对膝骨关节炎小鼠关节软骨IL-I、NOS基因表达的影响［J］.山西医药杂志，1999，28(5):381-384.

［12］ 曾意荣，樊粤光，吴凡，等.膝骨关节炎患者血清基质金属蛋白酶3、肿瘤坏死因子Q、白细胞介素1、透明质酸、脂质过氧化物含量及超氧化物歧化酶活性变化与活血补肾中药的干预［J］.中国组织工程研究与临床康复，2008，12(28):2436-2439.