艾灸头部组穴对VD大鼠脑内VEGF及其受体Flt-1、Flk-1 mRNA表达的影响*

王 频杨 骏张庆萍石海平马 岚

（1.安徽中医学院，安徽 合肥 230038；2.安徽中医学院第一附属医院，安徽 合肥 230038）

艾灸头部组穴对VD大鼠脑内VEGF及其受体Flt-1、Flk-1 mRNA表达的影响*

王 频1杨 骏2张庆萍1石海平2马 岚1

（1.安徽中医学院，安徽 合肥 230038；2.安徽中医学院第一附属医院，安徽 合肥 230038）

目的 观察艾灸头部组穴治疗血管性痴呆（VD）大鼠皮层、海马内VEGF及其受体Flt-1、Flk-1 mRNA表达，研究艾灸调控VD脑内血管新生机制。方法 选取Wistar雄性老年大鼠，四血管阻断法制备大鼠VD模型，电脑随机数字表法随机分为艾灸组、西药组、模型组，另设假手术组对照。艾灸组取百会、大椎、神庭穴艾灸治疗，西药组茴拉西坦灌胃共2个疗程。神经行为学评分并结合跳台仪检测治疗前、第2疗程后学习记忆成绩；RT-PCR检测各组大鼠皮层、海马内VEGF及其受体Flt-1、Flk-1 mRNA的表达水平。结果 经2个疗程治疗后，动物跳台实验的潜伏期、错误次数，以及神经行为学评分，艾灸组、西药组与模型组均有非常显著差异，表明艾灸、西药在提高VD大鼠潜伏期，降低VD大鼠错误次数以及对神经行为学评分影响均有明显疗效，且艾灸组明显优于西药组。与模型组相比，艾灸组皮层内VEGF及其受体Flt-1 mRNA的表达有明显差异，海马内VEGF及其受体Flk-1 mRNA的表达有显著差异；而西药组仅显示海马内VEGF或皮层Flt-1表达上调，没有观察到同一脑区VEGF及其受体同步明显表达。结论 艾灸在改善VD大鼠学习记忆成绩、神经行为学评分的同时，通过调控VEGF及其受体Flt-1、Flk-1 mRNA的表达水平，促进了要害部位的血管生成，并最终激发了脑内神经的损伤修复机制。

血管性痴呆 艾灸 血管生成 VEGF Flt-1 Flk-1

血管性痴呆（vascular dementia，VD）临床表现以神经系统定位损害的症状和体征为主。该病的发生与皮层病变，尤其是左侧皮层缺血及丘脑、海马的缺血性改变密切相关［1］。本课题组多年的临床经验证明，艾灸治疗该病有一定的疗效［2-4］，但机制尚不明确。本研究采用动物实验的方法，检测艾灸对VD大鼠要害部位皮层、海马内促进血管生成的关键因子血管内皮生长因子（VEGF）及其受体fms样酪氨酸激酶-1（fms-like yrosine kinase-1，Flt-1）、血管内皮细胞生长因子受体2（Vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2/Flk-1）的表达，探讨艾灸治疗VD的促进血管生成机制，为该病治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与药物专用清艾条（6 mm×100 mm）由安徽中医学院附属医院中药制剂室加工；茴拉西坦胶囊（0.1 g×30片/瓶，无锡市凯西药业有限公司生产）；大鼠跳台仪，北京中国中医科学研究院提供；VEGF、Flt-1、Flk-1引物由上海生工生物技术有限公司合成；RTPCR两步法试剂盒购自上海生物工程公司；TRIzol由美国Vitrogen公司提供。

1.2 动物与分组SPF级雄性Wistar大鼠60只，体质量（300±30）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2009-0005。用跳台实验对动物进行筛选，筛除训练过程中反应过于敏感或迟钝的大鼠后进行下一步实验。电脑随机数字表法产生8只作为假手术组，其余大鼠复制VD动物模型，模型复制后4 d用跳台实验结合潜伏期成绩测试再次筛选模型成功大鼠并保留36只，随机分为艾灸组、西药组、模型组，每组12只。

1.3 模型制备采用改良的Pulsinelli’s四血管阻断（4VO）VD 动物模型［5］。 大鼠于术前 8～12 h 禁食，不禁水。10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，俯卧固定大鼠行背侧颈正中切口，逐层钝性分离组织，暴露双侧第1颈椎横突翼小孔，用直径0.5 mm的电凝针烧灼双侧翼小孔内的椎动脉，造成永久性闭塞。次日再将大鼠仰卧固定，行腹侧颈正中切口，钝性分离双侧颈总动脉，用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉10 min，间隔1 h后再夹闭10 min，共3次。颈总动脉夹闭2 min内瞳孔不散大者弃之。局部伤口缝合前均以庆大霉素处理防止感染。假手术组大鼠不热凝椎动脉，不夹闭颈总动脉，其他手术进程同模型组。在全部造模过程中保持动物肛温在37℃左右。造模同时采用跳台实验检测动物的学习记忆成绩。训练及测试时将动物置于内，适应3 min，熟悉环境，开始测试时将大鼠放在测试平台上，并开始计时，直到第一次跳到铜栅上所需时间记为潜伏期，5 min内从跳下铜栅再跳回平台上的次数算作错误次数，潜伏期和错误次数作为测学习试成绩。分别在造模前后测试VD大鼠学习记忆成绩，评定VD模型的成功。在治疗前、第2疗程后测试评判疗效。初次神经行为学评分在模型复制后4 d进行。治疗后评分在艾灸组和西药组第2疗程末次治疗结束后6 h进行。模型组评分与之平行。评分标准按Zea Longa等［6］制定的6级评分法改进：0分为无功能障碍；1分为不能伸展前肢；2分为向一侧旋转；3分为向一侧倾倒；4分为无自主活动伴意识抑制；5分为死亡。评分为1～4分则缺血损伤造模成功。

1.4 治疗方法艾灸组大鼠固定于自制的鼠板上，特制的大鼠头部固定器固定大鼠头部，保持其清醒状态下，选取百会穴、大椎、神庭穴剃毛点记，穴位的选取参照大鼠的穴位图谱，按照人体穴位的定位方法并参照大鼠骨骼与体形确定。用专用清艾条悬灸20 min。每日1次，15次为1疗程 ，共治疗2疗程，疗程之间休息1 d，常规饲养。西药组采用茴拉西坦灌胃治疗。根据人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表计算给药剂量。灌胃剂量为0.0625 g/kg体质量，蒸馏水混合成0.01 g/mL质量浓度的溶液，每日1次，疗程与艾灸组相同。假手术组和模型组与灸法实验组平行，但只作鼠板上固定而不作其他处理。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 标本采集 艾灸组、西药组大鼠在两个疗程结束后，并在跳台实验完成后进行脑组织取材。将大鼠10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，用咬骨钳夹断颈椎上端，剪开大鼠头部皮毛，血管钳仔细剥离大鼠头骨，使其整个脑部充分暴露，钝性分离血管神经及软组织织，取出大脑并将其轻置在DEPC擦拭的冰袋上，小心剥离海马并迅速取组织100 mg置冻存管液氮保存；将左侧脑组织自额叶至枕叶分为4等份A、B、C、D，迅速取B脑片皮质100 mg置冻存管 ，液氮保存备用。

1.5.2 RT-PCR方法 引物设计参考Genbank核苷酸序列资料，VEGF 正义链引物：5＇-GCTCTCTT GGGTGCACTGGA-3′， 反义链引物：5′-CACCGCCTTGGCTTG TCACA-3′，635 bp；Flt-1 正 义 链 引 物 ：5＇-TCATGCAAGCGGGCCAGACTCTCTTTC-3′， 反义链引物：5′-ATCT-CACGGGGCTCGGCGGGCTTATTT-3′，600 bp；Flk-1 正 义 链 引 物 ：5′-CATTGTGTCC-TGCATC-CGGGATAACCT-3′， 反义链引物：5′-TGTACACGATGCCATGCTCGTCAC-TGA-3′，600 bp；β-action 正义链引物：5′-AACCCTAAGGCCAACCGTGAA-3′，反义链引物：5′-TCATGAGGTAGTCGTTCAGGT-3′，265bp。

1.5.3 组织总RNA的提取 按TRIzol试剂说明书操作提取标本总RNA，并溶解于20 μL去RNA酶的灭菌双蒸水（DEPC处理ddH2O），经2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，并测定A260/A280，比值应在1.8～2.0之间，确定样品纯度，其余放在冰箱中保存备。

1.5.4 cDNA的合成与产物分析 严格按照逆转录试剂盒说明书进行操作。取5 μL反应产物在 2%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，通过紫外线凝胶成像分析系统对扩增产物条带进行分析，分别测定各扩增带吸光度，作为其mRNA水平的半定量指标。计算公式：吸光度比值=（VEGF、Flt-1、Flk-1扩增产物的光密度值/参照系统β-action扩增产物的光密度值）×100%。

1.6统

计学处理应用SPSS12.0统计软件。计量资料以（±s）表示，数据先进行方差齐性检验（检验水平α=0.10）。进行单因素方差分析，两两比较选用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1造模后4 d神经行为学评分及学习记忆成绩测试结果造模4 d后，8只假手术组大鼠潜伏期为（184.2±61.56）s明显高于造模大鼠（39.18±14.45）s（P＜0.01）。同时假手术组大鼠错误次数为（1.85±0.73）次，明显低于造模大鼠（6.06±1.15）次（P＜0.01）。 造模后模型组大鼠神经行为学评分为（2.83±0.78）分。表明VD模型大鼠的学习记忆成绩显著低下，VD造模成功。

2.2治疗后各组神经行为学评分及学习记忆成绩测试结果比较见表1。经方差分析，各指标3组间均有非常明显差异（F=40.53，F=46.30，F=22.83）。 与模型组相比，艾灸组及西药组的潜伏期、错误次数及神经行为学评分均有非常明显差异（P＜0.01）。艾灸组与西药组比较，潜伏期、错误次数及神经行为学评分有明显差异（P＜0.01或0.05）。表明艾灸、西药治疗均有效。而艾灸组潜伏期大于西药组，错误次数及神经行为学评分均小于西药组，艾灸治疗效果明显优于西药治疗。说明经两个疗程治疗后，艾灸、西药在提高VD大鼠潜伏期，降低VD大鼠错误次数及神经行为学评分方面效果显著，而艾灸组优于西药组。

表1 各组大鼠治疗后潜伏期、错误次数及神经行为学评分结果比较（±s）

表1 各组大鼠治疗后潜伏期、错误次数及神经行为学评分结果比较（±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与西药组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组 别 n 神经行为学评分（分）潜伏期（s） 错误次数（次）艾灸组 12 1.82±0.24**△西药组 12 2.03±0.22**141.40±21.60**△△ 2.11±0.37**△△105.74±18.75** 3.36±0.46**模型组 12 2.58±0.37 69.22±18.41 5.73±1.51

2.3各组治疗后皮层VEGF mRNA、Flt-1 mRNA、Flk-1 mRNA表达检测结果比较见表2。经过两个疗程治疗后，3组间皮层内VEGF及其受体Flt-1 mRNA表达的检测结果有明显差异，Flk-1 mRNA表达无明显差异。与模型组相比，艾灸组VEGF、Flt-1 mRNA的表达有极显著差异（P＜0.01），西药组仅Flt-1 mRNA的表达有显著差异（P＜0.05），而 VEGF、Flk-1 mRNA表达无明显差异。与西药组相比，艾灸组VEGF、Flt-1 mRNA的表达明显提高 （P＜0.01），而两者间Flk-1 mRNA表达无差异。3组间海马内VEGF及其受体Flk-1 mRNA表达的检测结果有显著性差异 （F=38.72，F=30.35），Flt-1mRNA 表达无差异。与模型组相比，艾灸组VEGF、Flk-1 mRNA的表达增强，有显著差异 （P＜0.01）， 而西药组仅VEGF的表达上调 （P＜0.01），其两个受体 Flt-1 mRNA、Flk-1 mRNA 表达无明显差异。与西药组相比，艾灸组海马内VEGF、Flk-1 mRNA的表达水平较高，有非常显著差异（P＜0.01），而两者间Flt-1 mRNA表达差异无统计学意义。

表2 各组皮层及海马内VEGF mRNA、Flt-1 mRNA、Flk-1 mRNA 表达比较（±s）

表2 各组皮层及海马内VEGF mRNA、Flt-1 mRNA、Flk-1 mRNA 表达比较（±s）

?

3 讨 论

近年来发现，VEGF在缺血缺氧性损伤疾病中发挥着重要的作用，具有保护内皮细胞，加速毛细血管再生，阻止神经细胞凋亡，刺激神经元轴突的生长，调节血管干细胞的分化、调节神经干细胞增殖分化等多方面作用［7-9］。VEGF在正常脑组织中仅有少量表达，在脑缺血发生后，低氧作为一种信号激活VEGF及其受体系统，促使VEGF表达升高，尤其在海马、皮层等对缺血敏感的区域。VEGF促新生血管生成作用是通过靶细胞上的相应受体介导的，VEGF与其受体Flt-1、Flk-1结合后，具有促进内皮细胞增殖和迁移的作用，从而加速新血管的形成。VEGF受体家族Flt-1和Flk-1，在促新生血管生成过程中，具有各自特异的生物学特性，研究发现由Flt-1介导的信号转导系统中，由于缺乏丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）相关途径，其生物学效应更多表现为诱导内皮细胞的迁移，而促内皮细胞增殖作用不明显，但刺激神经干细胞增殖作用显著［7，10］，有利 于 缺血损 伤后的 神经修 复 。 VEGFR-2（Flk-1）介导的信号转导通路中存在完整的丝裂原活化蛋白激酶相关途径，其生物效应表现为细胞形态学改变，包括肌动蛋白的改组，细胞膜皱缩，趋化性和促有丝分裂能力显著［11］，因此促内皮细胞增殖作用明显。

本研究在多年的临床经验基础上，取头部的百会、大椎、神庭艾灸治疗，以临床常规益智类药物茴拉西坦为对照，经2疗程治疗，VD大鼠神经行为学评分及学习记忆成绩测试，均出现了不同程度改善，验证了艾灸治疗VD的疗效优于茴拉西坦。观察VD脑内要害部位左侧皮层、海马内VEGF及其受体Flt-1、Flk-1 mRNA的表达，结果发现，艾灸的疗效取得与VD皮层、海马内VEGF及其受体Flt-1、Flk-1 mRNA的表达正相关，并存在着皮层内VEGF/Flt-1同时上调和海VEGF/Flk-1马内 同时上调的信号机制。而西药组临床指标的改善与其脑内VEGF及其受体Flt-1、Flk-1 mRNA的表达的关系不够密切，尽管海马内VEGF表达也发生了较显著上调，但其受体Flt-1、Flk-1表达没有显著性差异，介导的信号转导机制不明确。因此根据本研究结果谨慎推测，艾灸在改善VD大鼠学习记忆成绩、行为学评分同时，可能存在着艾灸调控VEGF及其受体Flt-1、Flk-1mRNA的表达水平，促进了要害部位的血管生成，并最终激发了缺血损伤后的神经修复。机对照试验［J］.中西医结合学报，2010，8（7）：636-640.

［3］王频，杨骏，杨帆，等.化瘀通络灸法治疗血管性痴呆的临床观察［J］.中国中医急症，2009，18（2）：172-174.

［4］王频，杨骏，杨帆，等.艾灸头部组穴治疗血管性痴呆的临床研究［J］.中华中医药杂志，2009，24（10）：1348-1351.

［5］R Schmidt-Kastner，W Paschen，BGOphoff，et al.A modified four-vessel occlumodel for inducing in complete forebrain ischemia in rats［J］.Stroke，1989，20：936.

［6］Zea Longa E，Weinstein PR，Carlson S.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rat［J］.Stroke，1989，20：84-91.

［7］Madri JA.Modeling the neurovascular niche： implications for recovery from CNS injury［J］.J Physiol Pharmacol.2009 Oct，60（Suppl 4）：95-104.

［8］Ogunshola OO，Antic A，Donoghue MJ，et al.Paracrine and autocrine functions of neuronal vascular endothelial growth factor（VEGF） in the central nervous system［J］.J Biol Chem，2002，277（13）：11410-1145.

［9］Ogunshola OO，Stewart WB，Mihalcik V，et al.Neuronal VEGF expression correlates with angiogenesis in postnatal developing rat brain［J］.Brain Res Dev Brain Res，2000，119：139-153.

［10］Hiratsuka S，Maru Y，Okeda A，et al.Involvement of Flt-1 tyrosine kinase （vascular endothelial growth factor receptor-1）in pathological angiogenesis［J］.Cancer Res，2001，61（3）：l207-1213.

［11］Robinson CJ，Stringer SE.The splice variants of vascular endothelial growth factor（VEGF）and their receptors［J］.J Cell Sci，2001，114（5）：853-865.

［1］Roman GC.Facts，myths，and controversies in vascular dementia［J］.J Neurol SCI，2004，226（1-2）：49-52.

［2］王频，杨骏，柳刚，等.艾灸头部穴位为主对血管性痴呆患者脑脊液中生长抑素和精氨酸血管加压素水平影响的随

1mRNA Expression

Objective:To observe the expressions of VEGF，flt-1，Flk-1mRNA within the hippocampous and cortex of the vascular dementia （VD）rats and to study the mechanism of angiogenesis of the treatment by moxibustion.Methods:Wistar health elderly male rats was selected.4-vessle occlusion was used to prepare the vascular dementia model.The model rats was dIvided into 3 groups by the digit schedule such as the moxibustion group，the western medicine group ，the model group.The sham operated group was set to contrast.the moxibustion group rats treated by moxibustion on the point of baihui（GV20），shenting（GV14） and dazhui（GV24）.The western medicine group rats was treated with Aniracetam for 2 courses.step-down avoidance test，nerve behavior test and nervial behavior scores were implemented before the treatment and after the 2 courses treatment，respectively.And test the expression level of VEGF，flt-1，Flk-1mRNA within the hippocampous and cortex of the rats after the treatment in RT-PCR ways.Results:After 2 courses treatment，the test scores in latent period ，error times and nervial behavior scores showed that the moxibustion group and the western medicine group had significant difference compared with model group.The moxibustion group got better than the western medicine group，which explain that the moxibustion group and the western medicine group had their own treatment effect in curing VD but the moxibustion group had more effective.Statistics of the level of VEGF，flt-1，Flk-1mRNA that the VD rats hippocampus and cortex positive cells expressed showed that the moxibustion group had significant difference compared with model group but the western medicine group had no significant difference.the moxibustion group got the higher level of VEGF，flt-1，flk-1mRNA than western medicine group too.These all showed that the moxibustion was more effective in increasing the positive cells expression within the VD rat hippocampus and cortex，and the western medicine had no similar effect in curing VD.Conclusion:Moxibustion has the effect in improving behavioral score and memory performance in VD rats，and it maybe exist the mechanisms of control ex-pression level of VEGF，flt-1，Flk-1mRNA within the hippocampous and cortex.In particular，the moxibustion raise the key factor VEGF，lt-1 Flk-1mRNA expression，and promote angiogenesis in the vital parts，and ultimately stimulate mechanisms of repairation of brain nerve njury.

WANG Pin1，YANG Jun2，ZHANG Qing-ping1，et al.1 Anhui University of TCM ，Anhui，Hefei 230038，China；2 The First Affiliated Hospital of Anhui University of TCM，Anhui，Hefei 230038，China

Vascular dementia；Moxibustion；Angiogenesis；VEGF；Flt-1；Flk-1

R245

A

1004-745X（2013）06-0861-04

国家中医药管理局针灸学重点学科开放基金研究项目（2011zjxk007）；安徽省高等学校省级自然科学研究项目（kj2012z217）；安徽省自然科学基金项目（1308085MH173）

Moxibustion Head Acupoints on Vascular Dementia Rats Affection of VEGF and Its Receptor Flt-1，Flk-

2013-03-27）