凝胶层析分离桔梗皂苷方法的研究

张海华，王 鑫，徐丽萍

(哈尔滨商业大学食品工程学院省高校食品科学与工程重点实验室，哈尔滨150076)

桔梗属于大宗药材品种，形似人参，药食两用，素有“南方人参”的美誉.桔梗不仅是一种传统中药[1]，还是一种食品，其中含有多种氨基酸，以及钙、镁、铁、锌、锰、铜、铅、磷等人体必需微量元素，此外桔梗中还含有大量亚油酸等不饱和脂肪酸、多聚糖、无机盐、甾体类化合物等[2].桔梗中含有的大量亚油酸等不饱和脂肪酸，具有降压降脂、抗动脉粥样硬化等多种作用，由此可见桔梗是一种很好的功能性食品.桔梗的主要活性成分为桔梗皂苷(platycodin，PD)，桔梗中三萜皂苷经近几年来的研究结果表明它在养禽业上具有重要的作用.三萜皂苷类有精神安定、放松肌肉和降温的作用.还具有抗癌、抗肿瘤作用，可抑制癌细胞的增长，对消化系统尤其是胃癌效果明显[3].

桔梗是我国销量最大的40种传统中药材之一.近年来，作为药食同源的传统中药，桔梗在免疫调节、抗炎、祛痰、保肝、降血脂等方面的药理作用引起了广泛关注[4].目前，研究较多的单体化合物为桔梗皂苷 A、B、C、D、D2、D3和远志皂苷 D、D2[5]，韩国学者将桔梗生药水提后过DiaionHP－20树脂得到水/丙酮系统不溶的浅黄色粉末状物质，即桔梗菊糖型多聚糖，发现其也具有丰富的药理作用[6－7].

1 材料与方法

1.1 实验材料

桔梗根，市售.

1.2 主要试剂与仪器

旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司);葡聚糖凝胶层析柱G－25(上海君威生物科技有限公司)紫外可见分光光度计TU－1900型(北京普析通用仪器有限责任公司);微型植物粉碎机FZ102机型(天津市泰斯特仪器有限公司);旋转蒸发器R－205型(上海申胜生物技术有限公司);电子分析天平ALC－1100.2型(北京赛多利斯仪器系统有限公司);电子恒温水浴箱DK－98－1型(天津市泰斯特仪器有限公司);半自动收集器(北京艾杰尔科技有限公司)无水乙醇(天津市天新精细化工开发中心);甲醇(哈尔滨新春化工厂);浓硫酸(哈尔滨市新达化工厂);氢氧化钠(天津市化学试剂三厂);高氯酸(哈尔滨理工化学试剂有限公司);冰醋酸(哈尔滨理工化学试剂有限公司);香草醛(天津市天新精细化工开发中心);人身皂甙标准品(上海思域化工科技有限公司)

1.3 实验方法

1.3.1 超声波水提法提取桔梗总皂苷

将新鲜桔梗烘干，采用粉碎机粉碎成末，取一定桔梗碎末放入锥形瓶中，加入10倍蒸馏水，超声振荡30 min(保持水温＜60℃，超声功率50 W)提取桔梗总皂苷.对提取液进行过滤，弃去滤渣，收集滤液.沉淀再次加水100 mL，同上处理，再提取1次，合并2次提取液，将滤液用旋转蒸发器进行浓缩.

1.3.2 人参皂苷标准曲线的绘制

1)人参皂苷最大吸收波长的确定

配制质量浓度为0.2 mg/mL的人参皂苷标准品溶液，以蒸馏水作为标准空白，采用1 cm石英比色皿，双光束紫外分光光度法，在波长为190～400 nm范围内进行扫描，确定人参皂苷最大吸收波长.

2)人参皂苷标准曲线的绘制

分别取不同体积质量浓度为0.2 mg/mL的人参皂苷标准溶液，定容至25 mL.分别于最大吸收波长处测其吸光值，以人参皂苷质量浓度(mg/mL)为横坐标，最大吸收波长下的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线.

1.3.3 凝胶层析分离桔梗皂苷单因素的选择

以桔梗皂甙分离效果为指标，根据实验条件和相关文献确定影响提取效果的因素，如乙醇体积分数、上样量、流速.为了确定实验中各因素对桔梗皂甙分离效果的影响，进行单因素实验.即改变某一条件，固定其他条件，确定桔梗皂甙的分离效果.

1)乙醇体积分数单因素实验

将样品进行进行预处理后，分别让其通过凝胶色谱柱进行层析.采用乙醇作为洗脱溶剂，分别选取乙醇体积分数为60%、65%、70%、75%、80%，凝胶体积与上样量比为1∶4，流速为1 mL/min，考察乙醇体积分数对洗脱效果的影响.

2)料液比单因素实验

将样品进行进行预处理后，分别让其通过凝胶色谱柱进行层析.采用凝胶体积与上样量的比值分别为 1∶2、1∶3、1∶4 、1∶5、1∶6，流速为 1 mL/min，乙醇体积分数为75%，考察上样量对洗脱效果的影响.

3)洗脱剂流速单因素实验

将样品进行进行预处理后，分别让其通过凝胶色谱柱进行层析.采用凝胶体积与上样量的比值分别为1∶4，流速分别为 0.5、1、1.5、2.0、2.5 mL/min，乙醇体积分数为75%，考察洗脱剂流速对洗脱效果的影响.

1.3.4 凝胶层析分离桔梗皂苷最佳条件的选择

根据单因素实验的结果，选择影响洗脱效果的三个主要因素:乙醇体积分数(A)、料液比(B)、洗脱剂流速(C)，采用正交设计表L9(34)安排实验.因素水平表见表1.

表1 正交试验因素水平表

1.3.5 桔梗皂苷定量分析实验

分别取纯化所得到的50管样品各2.5 mL，分别加入甲醇溶液2.5 mL，摇匀.水浴挥去溶剂.加入新配制的5%香草醛－冰醋酸0.1 mL，高氯酸0.4 mL.在60℃水浴中加热15 min，流水冷却.加冰醋酸2.5 mL，摇匀，放置15 min.在 546 nm 下用722分光光度计测吸光值，甲醇溶液随行空白对照.分别测出50管样品的吸光度，根据标准曲线计算每管样品中桔梗皂苷含量.

1.3.6 桔梗皂苷定性分析实验

1)泡沫实验

取桔梗总皂苷提取液10 mL于试管中强列振摇，观察其现象，记录泡沫持续时间.

取2支试管，分别加入0.1 mol/L盐酸液5 mL、0.1 mol/L氢氧化钠液5 mL，再各加入桔梗总皂苷溶液，分别调整pH值为1、13，强烈振摇，观察.

2)颜色反应实验

①醋酐－硫酸反应(Liebermann Burchard)

取桔梗总皂苷粉末1 g，加1∶20浓硫酸数滴，观察其颜色变化.

②三氯醋酸反应(Rosen－Heimer)

将桔梗总皂苷溶液滴在滤纸上，喷三氯醋酸试剂，加热，观察在不同温度下其颜色变化.

2 结果与讨论

2.1 超声波水提法提取桔梗总皂苷结果与分析

用超声波－水提法提取桔梗总皂苷，并用水饱和正丁醇对桔梗粗皂苷浓缩溶液进行萃取提纯，经三次平行实验计算桔梗总皂苷提取率.见表2.

表2 超声波水提法提取桔梗皂苷结果表

超声波具有空化、粉碎、拢拌等特殊作用，可以破坏植物细胞，使溶剂渗透到植物的细胞中，以使于植物中的化学成分溶于溶剂之中.采用超声波－水提法提取桔梗总皂苷的提取率比较高，比传统回流加热的方法要节省大量时间，可满足桔梗总皂苷的快速提取要求.而利用水作为溶剂提取桔梗总皂苷比使用乙醇等有机溶剂作为溶剂的提取方法，不但能获得较高的提取量，而且安全性有了提高，同时在保证了桔梗作为药食两用性食品原料的开发可能的同时也节省了大量的试剂.超声波－水提法提法提取的桔梗总皂苷提取率最高为4.25%.

2.2 人参皂苷标准曲线绘制结果与分析

2.2.1 桔梗皂甙最大吸收波长的确定

以人参皂苷Rg1作标样，利用紫外可见分光光度计对人参皂苷Rg1标样进行光谱扫描，确定人参皂苷Rg1标样的最大吸收波长为201 nm，扫描结果见图1.

图1 人参皂苷标准品紫外扫描图谱

2.2.2 皂苷标样标准曲线的绘制

标准曲线的绘制结果:在546 nm下用722分光光度计测定不同质量浓度人参皂苷Rg1标样的吸光值，拟合得回归方程:y=37.357x+0.014 9(r2=0.995 5)，绘制标准曲线见图2.

图2 皂苷标样的标准曲线

2.3 凝胶层析分离桔梗皂苷方法的研究

采用凝胶层析方法，选取影响桔梗皂甙分离效果的主要因素:乙醇体积分数、上样量、流速，对三个因素分别进行单因素实验，以分离效果为指标，确定三个因素下对桔梗皂甙提取效果的影响.2.3.1 洗脱剂体积分数的选择结果与分析

从图3中可以看出，通过对乙醇体积分数60%、65%、70%、75%、80%的变化进行实验测定，在乙醇体积分数为75%时，达到最大吸光值.吸光值越大，根据绘制的标准曲线方程，桔梗皂苷含量也就越高.所以在采用凝胶层析法分离桔梗皂苷时，选择75%的乙醇体积分数为最佳分离条件.

图3 乙醇体积分数对桔梗皂甙分离效果的影响

2.3.2 上样量的选择结果与分析

从图4中可以看出，通过对凝胶体积与上样量的体积比1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 分别进行实验测定，得到在凝胶体积与上样量的体积比为1∶4时，达到最大吸光值，根据标准曲线方程，桔梗皂苷含量也就越高.因此在采用凝胶层析法分离桔梗皂苷时，选择凝胶体积与上样量的体积比为1∶4为最佳分离条件.

图4 上样量对桔梗皂甙分离效果的影响

2.3.3 流速的选择结果与分析

从图5中可以看出，采用流速为1 mL/min时，通过对洗脱剂流速的控制，得出在流速为1 mL/min时，桔梗皂甙达到最大吸光值.由此可见，在采用流速为1 mL/min时，洗脱剂用量与上样量比为1∶1最佳，以免浪费洗脱剂用量，节省资金.

图5 洗脱剂流速对桔梗皂甙分离效果的影响

2.4 凝胶层析分离桔梗皂苷最佳条件结果与分析

通过正交实验确定最佳的分离方法，考察指标为桔梗皂苷最佳吸光值，其实验结果见表3.

由极差分析可知，影响桔梗皂苷分离因素的主次顺序依次为洗脱剂流速(C)、乙醇体积分数(A)、料液比(B).最佳工艺条件为A2B2C1，即乙醇体积分数70%，料液比1∶4，洗脱剂流速1.0 mL/min.

表3 正交试验结果表

2.5 桔梗总皂苷定性结果分析

2.5.1 泡沫试验结果分析

经试验验证，桔梗皂苷溶液经振摇后产生持久性泡沫15 min以上(即为阳性反应)且两支试管产生泡沫的高度相同，由此可以证明桔梗皂苷中含有三萜皂苷.

2.5.2 颜色反应试验结果分析

1)醋酐－硫酸反应(Liebermann Burchard)

醋酐－硫酸反应是检验皂苷的常用方法，皂苷与醋酐－浓硫酸反应，产生颜色变化，显紫色－粉红色的为三萜皂苷，甾体皂苷显蓝－绿色.

试验结果显示桔梗总皂苷溶液的醋酐－硫酸反应显紫色－粉红色，由此可以证明其含有三萜类皂苷.

2)三氯醋酸反应(Rosen－Heimer)

皂苷与三氯醋酸试剂反应产生颜色变化，在60℃时能显红色－紫色变化的为甾体皂苷，在100℃时才出现红色－紫色的变化，为三萜皂苷.

试验结果显示桔梗总皂苷在100℃显示红色－紫色，由此可以证明其含有三萜类皂苷.

3 结语

本文以桔梗为原料研究了桔梗总皂苷纯化的最佳分离条件.分别采用不同洗脱剂体积分数、上样量、流速、洗脱剂用量对桔梗总皂苷进行凝胶层析，以桔梗皂苷纯化率为指标确定凝胶层析分离桔梗皂苷最佳工艺条件为:乙醇体积分数70%，凝胶体积与上样量比为1∶4，流速为1 mL/min，洗脱剂用量与上样量为1∶1.在经过纯化的分离条件下进行实验，桔梗总皂苷的纯化率达到了38%.通过定性试验判定桔梗总皂苷含有三萜皂苷.

[1] 魏尚洲.桔梗资源的综合开发利用[J].陕西科技大学学报，2005，23(5):141 －143.

[2] 矫艳春.桔梗资源的开发利用[J].人参研究，2000，12(2):21－22.

[3] 李喜风，薛秋萍，藿诚明.桔梗中总皂苷的含量测定[J].中医药学刊，2006，12(24):22－32.

[4] 徐宝军，郑毅男.桔梗总皂甙制备工艺研究[J].大连大学学报，2000，21:277 －279.

[5] 高铁样，游秋云.野生桔梗与栽培品止咳作用的实验研究[J].现代中西医结合杂志，2001，10(16):1525－1526.

[6] KUBO M，NAGAO T，MATSUDA H，et al.Pharmacological Studies on Platycodi Radii(I).Effect on the Phagocytosis in Mouse[J].Shoyakugaku Zasshi，1986，40(4):367.

[7] 王 鑫，徐丽萍，张海华.超声波辅助提取桔梗皂苷方法的研究[J].哈尔滨商业大学学报:自然科学版，2012，28(3):352－356.