利用原核表达的外壳蛋白制备草莓轻型黄边病毒抗血清

代红艳　于翠梅等

摘 要：【目的】探索以原核表达的草莓轻型黄边病毒（SMYEV）外壳蛋白（CP）为抗原制备抗血清的方法，从而建立利用ELISA检测SMYEV的技术体系。【方法】利用IPTG诱导SMYEV CP重组蛋白在大肠杆菌中表达，分离纯化重组蛋白并以其为抗原对新西兰兔进行免疫。血清效价达到要求后，分离纯化抗血清并利用DAC-ELISA对草莓植株进行SMYEV检测，同时利用RT-PCR对DAC-ELISA检测结果进行验证。【结果】宿有SMYEV CP基因的大肠杆菌经IPTG诱导后出现一条52.0 ku左右的特异性重组蛋白谱带，以纯化的重组蛋白为抗原制备出专一性较强的针对SMYEV的抗血清，该抗血清稀释800倍后仍能有效检测草莓植株中的SMYEV。利用DAC-ELISA和RT-PCR对26份草莓试材分别进行SMYEV检测，2种检测方法的检测结果基本一致。【结论】以原核表达的SMYEV CP为抗原可以制备出专一性较强、效价较高的SMYEV的抗血清。

关键词： 草莓轻型黄边病毒（SMYEV）； CP； 原核表达； 抗血清； ELISA

中图分类号：S668.4 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-0578-04

草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus， SMYEV）是一种严重危害草莓生产的病毒，通过蚜虫持久性传播，在世界上广泛分布[1]。SMYEV归属于马铃薯X病毒属（Potexvirus），其病毒粒子为线形，基因组为1条单链RNA，全长约6 000个核苷酸，包含5个开放阅读框（ORF）[2]。随着SMYEV在世界各地广泛传播，SMYEV生物学特性也不断变化，不同分离物在不同草莓病毒指示植物上症状表现多样，这为病毒鉴定、病害防治带来了困难[3]。

病毒检测是病毒研究的一项重要内容，简单、快速、灵敏的病毒检测方法的建立对于病毒病的防治具有重要意义。早期检测SMYEV的方法为指示植物小叶嫁接法，其周期长，检测效率较低[1]。近年来，RT-PCR成为SMYEV检测的主要方法[4-6]。利用RT-PCR检测病毒具有灵敏度高、周期短、试材用量少等优点，但是成本较高，而且对实验室条件和操作人员的素质要求也较高。基于抗血清的酶联免疫吸附分析（ELISA）是病毒检测中常用的方法之一，具有快速、成本低廉、灵敏度高等优点，可以大规模应用于植物病毒的检测[7]。应用ELISA技术检测病毒的前提条件是具有该病毒的抗血清。传统的病毒抗血清制备是以纯化病毒粒子为抗原，SMYEV在草莓植株内含量较低，病毒粒子的纯化很困难[8]。以原核表达病毒外壳蛋白（coat protein， CP）为基础的抗血清制备，克服了传统通过提纯病毒粒子并以病毒粒子为抗原制备抗血清的种种弊端，并且能够大量获得特异性高的抗血清。这种技术已在柑橘速衰病毒（Citrus tristeza virus）[9]、沙地葡萄茎痘伴随病毒（Rupestris stem pitting associated virus）[10]、苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus）[11]、苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus）[12]等果树病毒上获得成功。

在克隆SMYEV分离物SY05的CP基因全长并实现在大肠杆菌中表达重组蛋白的基础上[13]，我们从大肠杆菌细胞中纯化SMYEV CP，并制备其抗血清，比较分析抗血清检测病毒与RT-PCR检测病毒的一致性与灵敏性，为通过ELISA技术大规模检测SMYEV奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

用于SMYEV检测方法比较分析的草莓试材有26份，分为两类：一类是离体保存的试管苗，品种为‘布兰登堡；另一类是草莓田间植株，包括25个品种。

1.2 SMYEV CP在原核细胞中诱导表达及电泳分析

1.3 抗血清制备

从菌液中分离纯化重组蛋白，然后以重组蛋白为抗原对2只成年新西兰兔进行免疫。初次免疫时将重组蛋白1 mL（1 g·L-1）与弗氏完全佐剂1∶1混匀后，用5 mL注射器进行背部多点注射。初次免疫后每2周加强免疫一次，加强免疫用同样量重组蛋白与不完全弗氏佐剂1∶1混合后背部皮下多点注射。每次加强免疫后14～15 d，从耳缘静脉取血液1 mL，常规方法分离血清，用间接ELISA法测定血清效价。血清效价达到要求后，取血并按照常规方法分离纯化抗血清。

1.4 DAC-ELISA检测SMYEV

1.5 RT-PCR检测SMYEV

2 结果与分析

2.1 SMYEV原核表达产物的SDS-PAGE分析

2.2 SMYEV抗血清的制备

2.3 SMYEV抗血清在病毒检测时的应用效价

2.4 ELISA与RT-PCR检测SMYEV效果比较

利用DAC-ELISA和RT-PCR分别对26份草莓材料进行SMYEV检测。DAC-ELISA检测结果显示，3份草莓材料携带SMYEV，分别是：‘布兰登堡、‘JA3田间苗和‘布兰登堡组培苗。RT-PCR 检测结果表明，3份ELISA检测表现阳性的试材在RT-PCR检测中也全部为阳性，但是有1份试材，即‘幸香田间苗，在DAC-ELISA检测中表现为阴性，而在RT-PCR检测中为阳性。

3 讨 论

ELISA方法因操作简便、成本低等特点适宜病毒的大规模检测，特异性抗血清的制备是其能否应用的关键。由于SMYEV在草莓的病毒含量极低，病毒粒体为柔软的线条形，进行病毒粒子纯化时，病毒粒体间易相互聚集，易被污染，因此通过病毒粒子的分离和提纯制备抗血清相当困难[8]。Jawee等[16]以昆诺藜中纯化出的SMYEV病毒粒子为抗原制备了SMYEV抗血清，但ELISA检测草莓田间带病毒材料时只在一定时期内（1月至5月）效果较好。本研究改变传统的以病毒粒子为抗原制备抗血清的方法，采用基因工程技术，利用原核表达的SMYEV的CP为抗原制备抗血清，克服了SMYEV病毒粒子难以分离提纯的困难，而且纯化的重组CP蛋白相对于提纯的病毒粒子而言，不含寄主植物的任何成分，不受寄主蛋白的干扰，所以所制备的抗血清特异性强。

本研究比较了ELISA与RT-PCR检测SMYEV技术的效果，结果表明1个RT-PCR检测阳性的样本未能通过ELISA检测出来，其可能的主要原因是ELISA检测病毒的灵敏度低于RT-PCR。Hu等[17]在检测香蕉植株中黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus）的研究中发现，RT-PCR检测CMV的灵敏性比ELISA高100倍，而Sanchez-Navarro等[18]在PNRSV上检测得到类似的结果。另一个可能的原因是血清型差异。目前GenBank中已报道SMYEV CP基因序列近30个，不同分离物间序列变异较大，存在较多插入、缺失位点，不同分离物核苷酸序列同源性也存在较大差异，因此SMYEV很可能存在血清型差异，从而影响ELISA检测病毒的效果。

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