超声波处理花粉介导‘黄花’梨遗传转化体系的建立

马倩倩　宋跃等

摘 要：【目的】建立超声波处理‘黄花梨花粉介导插入外源基因的技术体系。【方法】以‘黄花梨花粉为试材，检测不同蔗糖溶液中梨花粉破损率；通过中心组合设计方法，对超声波处理功率、处理时间、间隙时间、处理次数4个因子进行优化；利用含荧光蛋白基因的表达载体pCAMBIA 1304检测转化效率。【结果】梨花粉的适宜等渗溶液为15 g·L-1蔗糖溶液。超声波处理的梨花粉受体最佳参数为：超声波处理功率160～170 W，处理时间6～7 s，间隙时间7 s，处理次数7 次。 采用加入含GFP（green fluorescent protein）基因的pCAMBIA 1304表达载体质粒检测优化的超声波处理组合，梨花粉外源基因的插入效率为3%。【结论】研究确定了超声波处理‘黄花梨花粉遗传转化体系。

关键词： ‘黄花梨； 花粉介导； 超声波处理； 转化体系； GFP基因

中图分类号：S661.2 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-0537-06

梨是我国的第三大果树树种，其果实以爽口多汁、味美多样、营养丰富而深受消费者喜爱。但是，由于梨的杂种苗童期较长，多数重要性状受多基因遗传控制，同时为克服自交不亲和性而长期进行品种间杂交导致的基因组高度杂合等问题，使得梨的遗传改良效率相对较低，很难满足现代产业迅速发展的要求[1]。近年来，随着分子生物学技术发展以及对果树基因组学研究的不断深入，利用基因工程技术手段直接对目标农艺性状进行定向遗传改良，成为加速梨品种改良进程的一个重要选择途径。

目前梨上应用的转基因方法主要是农杆菌介导法，该转基因方法比较依赖于组织培养和转化体系建立，但不同梨品种之间的诱导再生效率差异较大[2]。例如，在NN69培养基上，‘Seckel品种的再生率为84%，而‘Louise Bonne Panachee仅有42%[3]。Leblay等[4]通过对‘Conference及‘Passe-Crassane叶片进行培养，发现2者的再生能力相差约50%。还有研究表明，农杆菌介导梨的转基因效率很低，Zhu等[5]在西洋梨砧木转化试验中，在3500张感染的叶片中都没有得到再生植株。而且，经农杆菌侵染梨叶片后不定芽再生率也很低，如‘砀山酥梨的再生率最高仅为19.09%[6]，‘丰产梨（Pyrus communis L.）的再生率最高仅为8.1%[7]。因此，十分有必要探索和寻找避免组织培养或植株再生的遗传转化方法。花粉管通道法是一种在植物上应用相对较多的非组培转基因方法[8]，在小麦[9]、水稻[10]和棉花[11-12]都曾成功获得变异子代。但是其操作难度较大，转化率低，结果可重复性差[13]，目前较少应用。而超声波处理花粉介导法是经改良的花粉管通道法，这种遗传转化方法简便、易操作，具有较强的实用性，不仅在玉米[14]、谷子[15]、花生[16]、野罂粟[17]等物种上成功获得转基因植株，在多年生果树如苹果[18]、葡萄[19]也尝试建立了相应的遗传转化体系，但在梨树上的探索和应用目前尚未见报道。因此，我们以‘黄花梨为试验材料，拟通过对影响转化效率的花粉及超声波处理有关参数的比较分析，以建立优化的梨花粉介导遗传转化体系，从而为该方法在梨转基因上的应用提供良好的技术和理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

‘黄花梨是生产中常用的授粉品种，因此选该品种为试验材料。采集处于大蕾期的‘黄花梨花朵，取花药部分，在25 ℃干燥环境中，晾晒至暴出花粉。花粉可直接使用，或低温、干燥条件下保存于干燥硅胶中备用。样品采自浙江省农业科学院梨种质资源圃。

1.2 梨花粉等渗溶液的筛选

取适量的‘黄花梨花粉分别悬浮于10、12.5、15、17.5、20、30 g·L-1蔗糖溶液（pH 6.5左右）中，在4 ℃冰箱中静置0.5 h。取处理后的花粉溶液滴在载玻片上，用×40倍的显微镜观察花粉的破损率（破损花粉包括处于发生质壁分离和细胞发生破裂两种状态下的花粉细胞）。每个处理进行3次重复，且每次随机选取视野，直至观察到1 000个花粉细胞为止，并统计花粉破损结果。整个操作过程在冰浴条件下进行。

1.3 超声波处理条件的优化

试验按照四因素五水平（表1）中心组合设计的组合进行超声波处理花粉，每次取0.06 g纯净花粉悬浮于3 mL花粉等渗溶液中，依次按照试验设计（表2）进行超声波处理，处理过的花粉沉淀15 min后，用胶头滴管取底部花粉溶液滴在载玻片上，用×40倍的显微镜观察，每个处理进行3次重复，且每次随机选取视野，观察花粉破损率，直至观察至1 000个花粉细胞为止，并统计花粉破损结果。破损花粉包括处于发生质壁分离和细胞发生破裂2种状态的花粉细胞。整个操作过程进行冰浴处理。

1.4 外源质粒载体的提取

选用含有GFP（green fluorescent protein）基因的pCAMBIA 1304 表达载体质粒（由南京农业大学生命科学院杨清教授赠予）为外源DNA。从LB固体平板上挑取抗性单克隆菌落接种于1.5 mL 含100 mg·mL-1卡那霉素的LB液体培养基中37 ℃ 250 r·min-1震荡培养5～6 h至饱和，然后将液体全部转入含有20 mL LB液体培养基的50 mL离心管中，37 ℃ 250 r·min-1震荡培养8～10 h。取2 mL菌液用碱裂解法提取质粒载体。

1.5 外源基因插入梨花粉的效率检测

取0.06 g纯净花粉悬浮于3 mL花粉等渗溶液中，按照超声波处理参数最佳组合进行1次处理，然后加入10 μL 浓度为70 mg·L-1 pCAMBIA 1304表达载体质粒混匀后，重复进行1 次相同超声波处理，该过程全部在冰浴条件下进行。处理后静置15 min，倒掉上清，用胶头滴管吸取沉底的花粉，滴在固体培养基[20] [30 mmol·L-1 MES（2-（4-Morpholino） ethanesulfonic aci），0.01%硼酸，0.03% CaCl2·2H2O，15.0%PEG（聚乙二醇）-4000，10% 蔗糖，pH值在6.5 左右，1.2%低熔点琼脂糖]上，25 ℃避光条件下，培养2 h，在宏光变倍体式荧光显微镜（日本OLYMPUS公司 设备型号：MVX10）下观察，用蓝光激发固体培养基的花粉，以统计外源基因的转化效率。

2 结果与分析

2.1 花粉等渗溶液的选择

2.2 超声波处理条件的优化

2.3 含GFP基因pCAMBIA 1304表达载体质粒的检测

2.4 以梨花粉为介导的GFP载体转化效率

用上述筛选的最佳超声波处理参数条件，即超声波处理功率160～170 W、处理时间6～7 s、间隙时间7 s、处理次数7次，对悬浮于15 g·L-1蔗糖等渗溶液中的梨花粉进行1次超声波处理后，加入pCAMBIA 1 304质粒，再进行1次相同条件的超声波处理。处理后取沉底花粉置于固体培养基上，25 ℃避光培养2 h，将载玻片置于体式荧光显微镜下，用蓝光激发观测外源基因表达结果。由图版可见，发绿色荧光的萌发花粉细胞即为转化成功的花粉细胞，观测多个视野中相似花粉细胞，并统计外源基因转化‘黄花梨花粉的效率为3%。

3 讨 论

采用花粉作为转化载体时，花粉细胞极易在溶液中吸胀破裂而失去活性，而在高浓度溶液中由于反渗作用会产生严重质壁分离影响花粉粒在柱头萌发；因此，必须选择含一定渗透压的溶液作为介质，使外源DNA既能与花粉粒充分接触，又能维持花粉粒正常的膨压。蔗糖溶液就是一种既可产生一定渗透压又不严重影响花粉活力的溶质，故本试验通过不同浓度的蔗糖溶液对比试验，确定15 g·L-1蔗糖溶液为梨花粉最佳等渗溶液。这一结论与梨花粉在蔗糖浓度为15 g·L-1时花粉萌发率最高[10]相一致。而玉米和苹果上分别采用5%、10%蔗糖溶液为超声波处理等渗溶液[14，18]，葡萄上采用25%蔗糖溶液为超声波处理等渗溶液[19]，可见，不同植物花粉粒所需蔗糖等渗溶液浓度是各不相同的。这可能是由于不同植物花粉细胞中淀粉、蛋白质、脂类、无机盐等物质的含量不同，因此它们的花粉细胞内渗透压也各不相同。

在外源基因导入花粉粒的过程中，影响超声波处理结果的因素有处理功率、处理时间、处理间隙时间、处理次数等。综合考虑这4个因素之间可能存在交互作用，本试验利用四因素五水平进行中心组合试验设计，并筛选出梨花粉最佳超声波处理参数为：超声波处理功率160～170 W、处理时间6～7 s、间隙时间7 s、处理次数7次。从转化机理方面分析，花粉介导法的关键在于不严重损伤花粉细胞，使它能携带外源DNA、并随花粉管生长顺利进入胚囊，形成合子，从而直接得到转基因种子[9]。与对葡萄花粉进行超声波处理相比[19]，梨超声波处理的最佳组合处理强度偏大。因此，也进一步说明了不同植物的花粉导入外源基因所需要的超声波处理条件存在差异，均应优化不同物种适宜的超声波处理参数，作为前期的技术保障。同时，本研究还采用报告基因表达载体进一步验证了转化体系的有效性和高效性。GFP基因作为报告分子和细胞标记最明显的优势是无需底物或辅因子参与，无论在活细胞还是在完整的转基因胚胎和动物中，都能有效地监测基因转移的效率[21]。GUS也常作为报告基因，但其检测结果假阳性很高，并且花粉内源性GUS会对试验结果造成严重的干扰[22]。因此，本试验选用GFP作为花粉转基因的报告基因，在优化的超声波处理参数条件下，利用GFP基因转入梨花粉的转化效率达到3%，相比葡萄的花粉转化效率4‰提高了近10倍[19]，从而进一步验证了本试验所筛选的超声波处理参数为有效参数，该转化体系可用于目标基因对梨的遗传转化研究。

综合以上研究来看，超声波处理梨花粉介导转基因方法是一种非组培转基因方法，不受基因型、再生能力等因素的制约，与传统的梨杂交育种相比，仅仅增加了超声波处理步骤，试验成本低且易操作，易被广大育种者应用到改良梨品种的实践中。此外，研究表明，梨的花粉在低温、干燥的条件下贮藏 1 a后，平均花粉发芽率仍可达到73.8%，无明显下降[23]。因此，我们不仅可利用梨的新鲜花粉为受体介导转化，也可以使用经过保存仍具有良好萌发率的贮藏花粉为受体，从而解决花期不遇的问题。因此，本研究建立的超声波处理介导花粉转基因方法对于梨的定向遗传改良具有重要的理论和实践意义。（本文图版见封2）

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