利用Solexa测序技术鉴定甜橙miRNAs

王永江　李中安等

摘 要：【目的】预测鉴定甜橙miRNA及其作用机制和功能，为深入研究挖掘甜橙miRNA及其抗病相关miRNA的作用等提供翔实的基因信息。【方法】利用高通量测序技术、相关的生物信息学软件和数据库，构建甜橙小RNA文库，然后以甜橙基因组为参考基因组，进行甜橙miRNA鉴定和靶基因预测；利用GO和KEGG数据库对靶基因进行功能分析。【结果】成功构建了甜橙小RNA文库：获得12 617 944条小RNA序列分属于3 065 625种小RNA序列，获得序列中24 nt长的序列最多，占到序列的49.3%。鉴定出2 199 561条miRNA，其中已知miRNA638 722条，分属52种miRNA家族，候选miRNA1 560 839条，分属204种miRNA。已知的52种保守miRNA基因预测出927个靶基因位点，候选miRNA中有154种预测出1 777个靶基因位点。GO数据库对靶基因分类显示，甜橙miRNA调控的靶基因主要参与多细胞互作、转录本调控和细胞组成等生物学途经和分子功能方面。KEGG数据库中病原物与寄主互作亚库分析结果显示，靶基因主要与抗性蛋白、转录因子和抗病酶等关联。【结论】预测鉴定出一批甜橙miRNA及其调控的靶基因，为进一步研究提供了参考信息。

关键词： 甜橙； miRNA； 靶基因； 高通量测序

中图分类号：S666.4 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪04-0526-11

甜橙是柑橘中栽培最多的一类品种，其种植面积占到柑橘总量的60%以上，对其研究具有重要意义。

MicroRNA（miRNA）是一类大小约为22 nt的内源小分子RNA，其主要由茎环结构的前体物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生，其在基因表达、基因组表观遗传修饰和抗病毒等方面起着重要的调控作用[1-5]。

随着第二代测序技术的广泛应用，大量利用新一代测序技术研究miRNA的试验被报道[6-13]。在柑橘miRNA的研究中，前人[11-13]通过高通量测序技术参考柑橘EST序列对枳中的miRNA进行研究鉴定；Xu等[10]通过高通量测序技术研究野生柑橘品种和普通品种间胡萝卜素合成相关的miRNA；Wu等[14]对茯苓甜橙体细胞胚胎发育期的特异miRNA进行研究，鉴定出与胚细胞发育调控紧密相关的10个miRNA；陈晓东[15]利用高通量测序技术对椪柑试管苗叶片中的miRNA进行鉴定，并对其进行分类注释，鉴定出一批miRNA。前期由于甜橙全基因组还没有被公布，研究者们以柑橘的ESTs序列为参考基因进行miRNA的预测鉴定[11-13]。2011年初甜橙 （Citrus sinensis）全基因组的首次公布为深入研究甜橙的基因功能提供了一个有力的平台，但还未见利用甜橙全基因组为参考基因组，深入全面的挖掘甜橙（C. sinensis）实生苗miRNA的报道，因此以甜橙全基因组作为参考基因组采用Solexa高通量测序技术研究甜橙miRNA具有重要的意义。我们的目的是挖掘出甜橙miRNA并预测其靶标位点，为深入研究甜橙miRNA的功能和作用机制等提供具有针对性的参考信息。

1 材料和方法

1.1 植物材料

选取2 a生西蒙斯甜橙（Citrus sinensis）实生苗5株，采摘其顶端嫩叶等量混合后提取总RNA，目的使提取西蒙斯甜橙的叶片RNA具有一定的代表性。该材料由国家柑橘苗木脱毒中心提供。

1.2 试剂

Trizol试剂购自Invitrogen公司，水饱和酚、氯仿、异戊醇、溴化乙锭（EB）、DEPC、琼脂糖等购自鼎国生物工程公司。核酸外切酶Ⅰ购自上海生工生物有限公司。

1.3 仪器

1.5 文库构建及其数据分析

1.6 保守miRNA的鉴定

利用miRBase（18.0）和NCBI相关数据库进行比对，找出保守的miRNA。保守miRNA的鉴定标准为：（1）测序序列与数据库中的保守序列匹配碱基数不少于16个碱基。（2）全序列错配碱基数不多于3个碱基。（3）空缺不超过2个碱基等。（4）存在茎环的前体二级结构。对鉴定出的保守miRNA进行首位碱基、序列位点碱基偏好性分析。

1.7 候选miRNA的预测鉴定

利用软件Mireap预测甜橙候选miRNA （novel-miRNA）。Mireap软件由华大基因公司开发，该软件根据miRNA前体的标志性发夹结构、前体物的二级结构、剪切子（Dicer）酶切位点信息、能量值等条件预测鉴定候选miRNA，具体条件参照前人[8，16-17]已报道的条件。（1）miRNA前体能折叠为发夹型二级结构。（2）成熟miRNA的候选序列位于发夹结构的一条臂上，而对应的miRNA*位于另一条臂上。（3）成熟miRNA和miRNA*的非匹配碱基数不能超过6个，miRNA*区不能形成发夹环。（4）预测的miRNA前体二级结构的自由能小于-18 kcal·mol-1。（5）miRNA中（A+U）含量必须在30%～70%。

1.8 miRNA靶标基因预测

利用Mireap软件对预测出的miRNA进行靶基因预测。参照Allen等[18]和Schwab等[19]方法。其标准为：（1）miRNA和靶靶标基因复合体间相邻位点的碱基错配数小于等于2个碱基。（2）miRNA和靶标基因间不得超过4个的错配（G-U为0.5个错配）。（3）miRNA和靶标基因复合体间，miRNA的5′端开始第2～12个位点错配碱基位点不得相邻。（4）miRNA和靶标基因复合体的第10～11个位点没有错配碱基。（5）在miRNA和靶标基因复合体间，miRNA5′端起第1～12个位点碱基错配数小于等于2.5（G-U为0.5个错配）。（6）miRNA和靶标基因复合体的最低自由能应大于等于miRNA与靶标基因最佳互补体时最低自由能的75%。

1.9 GO富集分析

1.10 KEGG通路分析

利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG）数据库（http：//www.genome.jp/kegg）进行靶基因调控代谢通路分析。对映射比对结果进行显著性富集，寻找与整个参考基因相比较在候选靶基因中显著性富集的通路，预测靶基因参与的调控代谢路径，筛选出参与病害互作通路的靶基因及相关的miRNA，为进一步研究甜橙抗病基因提供针对性的基因信息。富集分析计算公式同公式（1）。

其中N为所有基因中具有通路注释的基因数目；n为N中的候选靶基因的数目；M为所有基因中注释为某特定通路的基因数目；m为注释为该特定通路的候选靶基因数目。概率P≤0.01的通路认为显著关联，即靶基因参与代谢通路的调控。

1.11 miRNA的液相杂交验证

选取部分小RNA进行荧光素探针标记，随后进行液相Northern杂交，方法参照Wang等[20]已报道的方法，其主要步骤有：（1）小RNA的提取分离；（2）核酸变性；（3）杂交，在低于每个探针Tm值10 ℃的温度下进行杂交2 h以上；（4）酶切，杂交后的反应溶液中添加核酸外切酶I进行酶切反应，37 ℃ 2 h，80 ℃ 10 min；阴性对照为探针直接进行酶切；（5）电泳分离，酶切产物进行PAGE胶电泳，紫外光下观察结果。

2 结果与分析

2.1 文库构建及数据分析

2.2 保守miRNA鉴定分析

鉴定结果显示，638 720条序列分属927种碱基序列类型，该927种序列类型比对数据库（miRBase18.0）中55个家族，其中数据库中的4个miRNA*也在测序数据库中鉴定到。

2.3 候选miRNA的鉴定分析

2.4 靶基因预测分析

保守miRNA的靶基因预测结果如表2所示，52种保守miRNA基因型预测到927个靶基因位点。其中，一个miRNA调控一个靶基因的miRNA有3个，一个miRNA调控2个或2个以上靶基因的miRNA有49个，如csi-miR156miRNA可调控63个靶基因位点。

miRNA丰富的靶基因信息为进一步靶基因功能预测分析奠定基础，为筛选与病害互作相关的基因提供了丰富的基因信息。

2.5 GO和KEGG数据库比对分析

结果显示甜橙中保守miRNAs的927个靶基因和候选miRNAs的1 777个靶基因在GO数据库中与分子功能、生物学过程和细胞组成3个亚库中都有关联，但其中最多的涉及生物过程（biological process ontology）和分子功能（the molecular function ontology），而与细胞组分（cellular component ontology）关联较少。与biological process亚库映射显著性关联的有66项，关联富集显著的前三个项分别为multicellular organismal process，其P值为6.64e-26，有2 192个基因映射关联； multicellular organismal development，其P值为7.34e-24，有1 924个基因映射关联； Transcription，其P值为1.05e-21，有1 306个靶基因映射关联。与molecular function显著关联的有12项，主要有核酸结合转录本因子的激活、氧化还原酶的激活、核酸结合等。在细胞组分的生物本论项中，有2项映射显著关联，分别为转录因子复合体（transcription factor complex）和核质（nucleoplasm）。

miRNA功能主要为信号传导，调控靶基因表达等。预测结果显示miRNA的靶基因主要与生物过程中的多细胞互作等项显著关联，结果与miRNA已报道的参与信号传导等功能相符。

KEGG数据库分析结果显示，靶基因最显著关联项为病原物与寄主互作代谢通路，其P值为4.14e-26，KO号04626。miRNA的靶基因主要与抗性蛋白、转录因子、受体酶等相关联。保守miRNA中，有143个靶基因与该数据高度相关联，这143个靶基因中主要受miR172、miR390、miR472、miR396c和miR482a等的miRNA调控。关联靶基因最多的为RPS2抗病蛋白，有133个靶基因与其显著相关，其次为RPM1抗病蛋白，有93个靶基因相关。在保守miRNA靶基因相关联的RPM1中的48个靶基因中，有5个是miR396c的靶基因、23个miR472的靶基因、20个miR482的靶基因。与RPS2相关联的39个靶基因中，有1个为miR396c的靶基因、11个miR472的靶基因、16个miR482a的靶基因、11个miR482b的靶基因（表3）。

2.6 miRNA 液相杂交

结果显示，阴性对照没有印迹，阳性对照和样品的杂交探针的印迹清晰（图版-H）。杂交结果进一步增强了甜橙miRNA预测结果的真实性和深度测序获得的miRNA的准确性。

3 讨 论

利用高通量测序技术检测鉴定miRNA，是当今发现和研究植物小RNA的一条重要途径。HiSeq2000测序仪由Illumina公司根据Solexa技术开发的第2代高通量测序仪器。该测序仪采用边合成边测序技术，减少因二级结构造成的一段区域的缺失；一次性可获得数百万小RNA序列，能够快速全面地鉴定该物种在该状态下的微小RNA并能发现新的微小RNA；另外所测得的小RNA几乎涵盖所有RNA，是目前研究小RNA主要测序仪器之一[21]。

本实验在鉴定保守miRNA时，鉴定到了数据库中4种miRNA*，由于miRNA*极易降解，在生物体内存在量不及miRNA的百分之一，能鉴定出miRNA*说明该实验构建的小RNA文库信息量丰富完整。同时，鉴定的保守和候选miRNA的成熟序列具有一般miRNA的5′端首位碱基偏“U”对“G”有抗性，第2～4位碱基缺“U”等普遍特性。前体物预测中，本研究预测miRNA前体物在62～362 nt与前人预测植物miRNA的前体物大小范围一致。以上这些结果进一步增强了结果的准确性和真实性，同时也说明甜橙miRNA的前体物具有丰富的多样性。

本研究测序获得的小RNA序列中，24 nt的小RNA为主，占到总数的49.03%，这与陈晓东等[15]利用深度测序技术研究椪柑miRNA时，所测得序列以24 nt的序列最多占总条数的48.66%研究结果一致。说明结果具有一定的代表性，同时也增强了该结果的准确性。另外，在多数植物中也存在同样现象，如苋菜试管苗[39]、拟南芥种子[40]等也是24 nt的reads最多，然而，有少数被子植物中以21 nt小RNA作为主要形式，如西红柿[6]、杨树（Populus）[41]、小麦（Triticum aestivum）[42]等。植物中不同DCL酶作用产生不同的大小的小RNA，DCL4酶作用产生21 nt的小RNA而DCL3酶产生24 nt大小的小RNA[2，4-5]；由此可推测甜橙植株内，小RNA的产生主要受DCL3酶作用。

对miRNA的靶基因KEGG的病原物与寄主通路分析显示，miRNA调控的靶基因有大量与病原物与寄主互作通路相关联，说明miRNA参与了病原物与寄主互作途径，为进一步研究甜橙抗感机制和基因提供了参考；同时也为研究甜橙miRNA在甜橙与病害互作用中的作用提供了思路和基因信息。在关联的靶基因与其对应调控的miRNA中，有些miRNA有多个靶基因，且多个miRNA的多个靶基因共同调控一个因子。如保守的miR472、miR390、miR396和候选的novel-m015等都具有多个靶基因，而这些靶基因同时调控一个蛋白或转录因子。同时，也存有一个miRNA的多个靶基因参与多个蛋白或酶的调控，如mi-R472和miR482的靶基因分别与RPM1、RPS2、RPS5等关联。这些关系的复杂性，为研究miRNA在病害与寄主互作中的作用提供了思路，同时也增加了研究的复杂性。

miRNA作为一个非常重要而且在飞速发展的研究领域，小RNA的形成机制与作用机理还有很多谜团有待进一步的挖掘探索。实验获得甜橙实生苗miRNA为进一步研究甜橙特异环境下特异miRNA提供了参考信息。甜橙特异环境条件下miRNA表达及其作用、基因调控网络分析结果的生物学验证、关键miRNA的功能与作用途径等还需进一步研究。

4 结 论

本实验鉴定出一批miRNA，并预测筛选出一批调控的靶基因与植物与病原物互作中高度相关的miRNA。为甜橙抗病基因的挖掘以及病原物互作信号传导等研究提供参考信息，为进一步的深入研究奠定了基础。（本文图版见插1）

参考文献 References：

[1] HUNTZINGER E， IZAURRALDE E. Gene silencing by microRNAs： contributions of translational repression and mRNA decay[J]. Nature Reviews Genetics， 2011， 12 （2）： 99-110.

[2] WU L， ZHOU H Y， ZHANG Q Q， ZHANG J G， NI F R， LIU C， QI Y J. DNA methylation mediated by a microRNA pathway[J]. Molecular Cell， 2010， 38（3）： 465-475.

[3] KIDNER C A， MARTIESSEN R A. The developmental role of microRNA in plants[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2005， 8： 38 -44.

[4] MALLORY A C， VAUCHERET H. Functions of microRNAs and related small RNAs in plants[J]. Nature Genetics， 2006， 38： 31-36.

[5] JOVER-GIL S， CANDELA H， PONE M R. Plant microRNAs and development[J]. International Journal of Developmental Biology，2005， 49： 733-744.

[6] MOXON S， JING R C， SZITTYA G， SCHWACH F， PILCHER R L R， MOULTON V， DALMAY T. Deep sequencing of tomato short RNAs identifies microRNAs targeting genes involved in fruit ripening[J]. Genome Research， 2008， 18： 1602-1609.

[7] FAHLGREN N， HOWELL M D， KASSCHAU K D， CHAPMAN E J， SULLIVAN C M， CUMBIE J S， GIVAN S A， LAW T F， GRANT S R， DANGL J L， CARRINGTON J C. High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs： evidence for frequent birth and death of miRNA genes[J]. PloS One， 2007， 2 （2）： e219.

[8] FRIEDLANDER M R， CHEN W， ADAMIDI C， MAASKOLA J， EINSPANIER R， KNESPEL S， RAJEWSKY N. Discovering microRNAs from deep sequencing data using miRDeep[J]. Nature Biotechnology， 2008， 26 （4）： 407-415.

[9] LI X Y， WANG X， ZHANG S P， LIU D W， DUAN Y X， DONG W. Identification of soybean microRNAs involved in soybean Cyst nematode infection by deep sequencing[J]. PloS One，2012，7（6）： e39650.

[10] XU Q， LIU Y L， ZHU A D， WU X M， YE J L， YU K Q， GUO W W， DENG X X. Discovery and comparative profiling of microRNAs in a sweet orange red-flesh mutant and its wild type[J]. BMC Genomics， 2010， 11（1）： 246.

[11] SONG C N， WANG C， ZHANG C Q， KORIR N K， YU H P， MA Z Q， FANG J G. Deep sequencing discovery of novel and conserved microRNAs in trifoliate orange （Citrus trifoliata）[J]. BMC Genomics， 2010， 11： 431.

[12] ZHANG J Z， AI X Y， GUO W W， PENG S A， DENG X X， HU C G. Identification of miRNAs and their target genes using deep sequencing and degradome analysis in trifoliate orange [Poncirus trifoliata L. Raf[J]. Molecular Biotechnology， 2012， 51： 44-57.

[13] SUN L M， AI X Y， LI W Y， GUO W W， DENG X X， HU C G， ZHANG J Z. Identification and comparative profiling of miRNAs in an early flowering mutant of trifoliate orange and its wild type by genome-wide deep sequencing[J]. PloS One，2012， 7（8）： e43760.

[14] WU X M， LIU M Y， GE X X， XU Q， GUO W W. Stage and tissue-specific modulation of ten conserved miRNAs and their targets during somatic embryogenesis of Valencia sweet orange[J]. Planta， 2011， 233（3）： 495-505.

[15] CHEN Xiao-dong. Germplasm conservation and microRNA identification of in vitro plantlets in citrus trees[D]. Fuzhou： Fujian Agriculture and Forestry University， 2011.

陈晓东. 柑橘试管苗种质保存及其 microRNA 鉴定[D].福州： 福建农林大学， 2011.

[16] LI Y， ZHANG Z， LIU F， VONGSANGNAK W， JING Q， SHEN B R. Performance comparison and evaluation of software tools for microRNA deep-sequencing data analysis[J]. Nucleic Acids Research， 2012，40（10）： 4298-4305.

[17] SONG Chang-nian， JIA Qi-dong， WANG Chen， LI Fei， ZHANG Zhen， FANG Jing-gui. Computational identification and analysis of the putative microRNAs in 32 fruit crops[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2010， 37（6）： 869-879.

宋长年，贾启东，王晨，李飞，章镇，房经贵. 32种果树microRNA的生物信息学预测与分析[J]. 园艺学报， 2010， 37 （6）： 869-879.

[18] ALLEN E XIE Z X， GUSTAFSON A M， CARRINGTON J C. MicroRNA-directed phasing during trans-acting siRNA biogenesis in plants[J]. Cell， 2005， 121： 207-221.

[19] SCHWAB R， PALATNIK J F， RIESTER M， SCHOMMER C， SCHMID M， WEIGEL D. Specific effects of microRNAs on the plant transcriptome[J]. Develompmental Cell， 2005， 8 （4）： 517-527.

[20] WANG X S， TONG Y A， WANG S H. Rapid and accurate detection of plant mirnas by liquid northern hybridization[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2010， 11（9）： 3138-3148.

[21] SUN Hai-xi， WANG Xiu-jie. The development and future perspectives of DNA sequencing technology[J]. e-Science， 2009， 6： 19-29.

孙海汐，王秀杰. DNA测序技术发展及其展望[J]. e-Science， 2009， 6： 19-29.

[22] CHINCHILLA D， BAUER Z， REGENASS M， BOLLER T， FELIX G. The Arabidopsis receptor kinase FLS2 binds flg22 and determines the specificity of flagellin perception[J]. The Plant Cell Online， 2006， 18（2）： 465-476.

[23] ZIPFEL C. Pattern-recognition receptors in plant innate immunity[J]. Current Opinion in Immunology， 2008， 20（1）： 10-16.

[24] ZIPFEL C， KUNZE G， CHINCHILLA D， CANIARD A， JONES J D G， BOLLER T， FELIX G. Perception of the bacterial PAMP EF-Tu by the receptor EFR restricts Agrobacterium-mediated transformation[J]. Cell， 2006， 125（4）： 749-760.

[25] SWIDERSKI M R， INNES R W. The Arabidopsis PBS1 resistance gene encodes a member of a novel protein kinase subfamily[J]. The Plant Journal， 2001， 26（1）：101-112.

[26] BENT A F， KUNKEL B N， DAHLBECK D， BROWN K L， SCHMIDT R， GIRAUDAT J， LEUNG J， STASKAWICZ B J. RPS2 of Arabidopsis thaliana： A leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes[J]. Science， 1994， 265（5180）： 1856-1860.

[27] WARREN R F， HENK A， MOWERY P， HOLUB E， INNES R W. A mutation within the leucine-rich repeat domain of the Arabidopsis disease resistance gene RPS5 partially suppresses multiple bacterial and downy mildew resistance genes[J]. The Plant Cell Online， 1998， 10（9）： 1439-1452.

[28] GRANT M R， GODIARD L， STRAUBE E， ASHFIELD T， LEWALD J， SATTLER A， INNES R W， DANGL J L. Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual specificity disease resistance[J]. Science， 1995， 269： 843-846.

[29] SHIRASU K， LAHAYE T， TAN M W， ZHOU F， AZEVEDO C， SCHULZE-LEFERT P. A novel class of eukaryotic zinc-binding proteins is required for disease resistance signaling in barley and development in C. elegans[J]. Cell， 1999， 99（4）： 355-366.

[30] WANG W， VINOCUR B， SHOSEYOV O， ALTMAN A. Role of plant heat-shock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response[J]. Trends in Plant Science， 2004， 9（5）： 244-252.

[31] WANG G F， WEI X N， FAN R C， ZHOU H B， WANG X P， YU C M， DONG L L， DONG Z Y， WANG X J， KANG Z S，LING H Q， SHEN Q H， WANG D W， ZHANG X Q. Molecular analysis of common wheat genes encoding three types of cytosolic heat shock protein 90 （Hsp90）： Functional involvement of cytosolic Hsp90s in the control of wheat seedling growth and disease resistance[J]. New Phytologist， 2011， 191： 418-431.

[32] CHICO J M， CHINI A， FONSECA S， SOLANO R. JAZ repressors set the rhythm in jasmonate signaling[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2008， 11： 486-494.

[33] ABE H， URAO T， ITO T， SEKI M， SHINOZAKI K， YAMAGUCHI-SHINOZAKI K. Arabidopsis AtMYC2 （bHLH） and AtMYB2 （MYB） function as transcriptional activators in abscisic acid signaling[J]. The Plant Cell Online， 2003， 15（1）： 63-78.

[34] DOMBRECHT B， XUE G P， SPRAGUE S J， KIRKEGAARD J A， ROSS J J， REID J B， FITT G P， SEWELAM N， SCHENK P M， MANNERS J M. MYC2 differentially modulates diverse jasmonate-dependent functions in Arabidopsis[J]. The Plant Cell Online， 2007， 19（7）： 2225-2245.

[35] BIRKENBIHL R P， DIEZEL C， SOMSSICH I E. Arabidopsis WRKY33 is a key transcriptional regulator of hormonal and metabolic responses toward Botrytis cinerea infection[J]. Plant Physiology， 2012， 159（1）： 266-285.

[36] JIANG Y Q， DEYHOLOS M K. Functional characterization of Arabidopsis NaCl-inducible WRKY25 and WRKY33 transcription factors in abiotic stresses[J]. Plant Molecular Biology， 2009， 69（1）： 91-105.

[37] YOSHIOKA H，NUMATA N，NAKAJIMA K， KATOU S， KAWAKITA K， ROWLAND O， JONES J D G， DOKE N. Nicotiana benthamiana gp91phox homologs NbrbohA and NbrbohB participate in H2O2 accumulation and resistance to Phytophthora infestans[J]. The Plant Cell Online， 2003， 15（3）： 706-718.

[38] KAPLAN B， SHERMAN T， FROMM H. Cyclic nucleotide-gated channels in plants[J]. FEBS letters， 2007， 581（12）： 2237-2246.

[39] LIU Sheng-cai， LIN Yu-ling， CHEN Xiao-dong， LAI Zhong-xiong. Novel and conserved miRNAs identification during in vitro flowering of Amaranthus by solexa sequencing[J]. Chinese Journal of Tropical Crops， 2011， 32（7）： 1296-1303.

刘生财， 林玉玲， 陈晓东， 赖钟雄. 利用Solexa 测序技术鉴定苋菜试管开花过程中的miRNAs[J]. 热带作物学报， 2011， 32（7）： 1296-1303.

[40] CHEN Dong-ju. Analysis of small RNA deep sequencing data during seed development in Arabidopsis thaliana[D]. Fuzhou： Fujian Agriculture and Forestry University， 2011.

陈冬菊.拟南芥种子发育过程小RNA深度测序数据的分析[D]. 福州： 福建农林大学， 2011.

[41] ABDELALI B， PHILLIP K W， SCOTT D， CLAUDE W D， JOHN E C. Conservation and divergence of microRNAs in Populus[J]. BMC Genomics， 2007， 8： 481.

[42] WEI B，CAI T，ZHANG R Z，LI A L，HUO N X，LI S，GU Y Q，VOGEL J，JIA J Z，QI Y J，MAO L. Novel microRNAs uncovered by deep sequencing of small RNA transcriptomes in bread wheat （Triticum aestivum L.） and Brachypodium distachyon （L.） Beauv[J]. Functional Integrative Genomics， 2009， 9： 499-511.