IMPACT-TWIN蛋白纯化系统的机制及其应用

张怡 谭树华

(1.中国药科大学生命科学与技术学院分子生物学教研室 江苏南京 210009;2.中国药科大学生命科学与技术学院 江苏南京 210009)

在利用基因工程进行蛋白的生产时,通常使用构建融合蛋白的方法,最常使用的融合蛋白标签包括大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白MBP,谷胱甘肽转移酶GST,组氨酸残基组成的融合标签TrxHIS等。借助于融合蛋白的特征和性质,能够大大简便蛋白的表达纯化、鉴定及检测过程。目前,通过构建融合蛋白进行表达在原核表达体系以及真核表达体系均有较广的应用。

当重组蛋白作为基因工程药品及其他一些用途时,由于融合标签是否会影响蛋白的性质和功能还有待考察研究,所以一般要求目标产物必须像天然蛋白质一样的完整产物,而不能以融合蛋白形式存在。因此,一般需要对融合表达产物进行产物后加工,即对融合蛋白在体外实施特定氨基酸序列的切割和断裂,获得完整的目的产物。目前最为常用的裂解方法有:(1)化学法:如用溴化氰断裂;(2)蛋白酶法:如用凝血酶,活化的Xa因子或肠激酶特异性裂解。由于溴化氰为剧毒化合物,而且其切割识别位点为Met,因此实用性不强。用蛋白酶进行切割时,要求工具酶:①能够识别并裂解特定的氨基酸序列;②为避免杂质蛋白酶引发不必要的裂解反应,需要高纯度的工具蛋白酶。但是目前常用的工具蛋白酶成本较高,价格昂贵,不利于放大生产。这样,就给IMPACT-TWIN蛋白纯化系统的应用提供了广阔的空间。

IMPACT-TWIN系统包括pTWIN1,pTWIN2两个表达载体,他们都使用了经改造过的Ssp DnaB内含肽作为intein1。两者的区别在于使用了不同的intein2,pTWIN1使用了改造后的Mxe GyrA内含肽作为intein2;而pTWIN2使用的是Mth RIR1内含肽。Intein是一个蛋白剪接元件,类似于基因组中的内含子intron在RNA剪接中的作用,intein在较低的温度和还原条件下会发生自身介导的末端裂解反应。此外IMPACT-TWIN系统另外一个重要元件几丁质结合蛋白域(CBD),CBD源于Bacillus circulans WL-2的几丁质酶A1的C端片段。由于CBD可高度特异地结合于几丁质上,可用来作为融合蛋白纯化过程中的亲和标签(Watanab et al.,1994;Chong et al.,1997;Xu et al.2000)。

IMPACT-TWIN系统的表达载体中,在多克隆位点两端都设计了一段intein和CBD的融合基因,如下:几丁质结合蛋白域(CBD)-intein1-MCS-intein2-几丁质结合蛋白域(CBD)。所以有3种融合方法,即目的蛋白的N-端,C-端或者N-端和C-端可同时融合上几丁质结合蛋白域(CBD)-intein。目的蛋白的N端连接Ssp DnaB自剪切元件时,可以通过改变pH和温度,而不需要使用任何化学试剂。Intein加到目的蛋白C端时,他们的的纯化是利用硫醇诱导Mxe GyrA或者Mth RIR1intein的剪切。

pTWIN质粒利用T7启动子控制融合基因的表达。在没有IPTG诱导表达时,阻遏物结合到lac操纵子序列上,融合基因的表达被抑制。pTWIN载体有氨苄抗性,可以使宿主菌拥有氨苄抗性。

蛋白表达纯化系统IMPACT-TWIN中,几丁质蛋白结构域(CBD)、蛋白自剪接元件(intein)、目的蛋白连接形成融合基因,在宿主细胞中表达,融合蛋白可利用CBD与几丁质亲和层析柱进行结合,此时,再利用在特定的条件下诱导内含肽的肽键裂解活性,目的蛋白与CBD及内含肽分开,从亲和层析柱释放出来,而内含肽与CBD仍结合在几丁质纯化介质上,达到了单柱分离纯化的目的。经过分析,此法得到的蛋白与天然蛋白一致,不会残留或缺失氨基酸,也避免了后续实验中蛋白酶与目的蛋白分离纯化的麻烦,是一种高效率,低成本,安全性高的蛋白质分离纯化系统。

IMPACT-TWIN分离纯化系统已在多领域得到应用。将CBD连接到intein的N端,突变的CBD序列连接到intein C端。40mM MESNA诱导过夜,intein N端发生剪切,CBD的C端则出现了一个硫酯键,N端含有半胱氨酸的抗体就可连接到CBD的C端,借助于几丁质柱材便可实现纯化过程(Sun L,Ghosh I,Xu M Q.Journal of immunological methods,2003,282(1):45-52.)。维他命D受体基因克隆到表达载体pTWIN1中,通过改变pH的方法,使目的蛋白N端的intein发生自剪切反应,释放出来维他命D受体蛋白(Collins E D,Espinoza A,Le L T N,et al.The Journal of steroid biochemistry and molecular biology,2010,121(1):121-123.)。IMPACT-TWIN蛋白表达纯化系统克服了有抗菌活性的β防御素表达困难的缺陷,提供了一个方便经济的表达方式,实现了其在临床上应用的可能(Zhao Y,Diao H,Ni Z,et al.Cellular and Molecular Life Sciences,2011,68(4):697-708.)。增强型绿色荧光蛋白(EGFP),自剪接元件intein,可以定位于细胞膜的冰核蛋白(INP)构成的融合蛋白,在室温pH10.0 Tris–HCl中,由于intein的自剪切,EGFP被释放出来,经离心即可获得目的蛋白。此过程不必涉及破菌过程,可用于重组蛋白的工业化生产(Wu J Y,Tsai T Y,Liu T T,et al.,2011,54(3):158-163.)。