HPLC法测定B族维生素片中维生素B12的含量

吴雨川 李桂红

(1.黑龙江省食品药品检验检测所 黑龙江哈尔滨 150001;2.哈药集团制药六厂 黑龙江哈尔滨 150056)

B族维生素是维持人体正常机能与代谢活动不可或缺的水溶性维生素,包括维生素B1、核黄素、烟酸泛酸、维生素B6、生物素、叶酸、维生素B12等。由于其水溶性,B族维生素在体内滞留的时间只有数小时,就会完全排出体外,所以,B族维生素必须每天补充。其中维生素B12又称钴胺素或氰钴素,是一种由含钴的卟啉类化合物组成的B族维生素,主要生理功能是参与制造骨髓红细胞,防止恶性贫血;防止大脑神经受到破坏。维生素B12是由细菌合成的,在动物组织中发现维生素B12在细胞分裂和生长中起关键作用,与叶酸关系密切[1]。

为了简便快捷的测定B族维生素片中维生素B12的含量,经查阅文献资料,制订了B族维生素片中维生素B12的检测方法[2]。本文采用高效液相色谱法测定其含量。该方法灵敏度高,重复性好,操作简便快捷,专属性强,且其辅料、溶剂对含量测定无干扰,浓度-峰面积线性关系良好,方法测定结果变异小,可有效控制本品质量。

1 仪器与试药

Waters2695高效液相色谱仪(Waters公司);超声波清洗机(RUC-5500DTB)电子天平(梅特勒公司);乙腈(色谱纯,美国TEDIA公司);磷酸(色谱纯,FLUKA公司)。维生素B12对照品(中国药品生物制品检定所100248-200201)。B族维生素片(生产企业提供,批号:20120401,20120402,20120403);水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

表1 回收率试验结果

表2 样品含量测定结果

高效液相色谱柱GRACE Alltima amino氨基柱(5μm,4.6*250mm),以3%磷酸溶液—乙腈(25:75)为流动相;流速为1.0ml/min,检测波长为361nm,柱温为30℃,进样量20μl。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的制备

避光操作。精密称取维生素B12对照品11.22mg,置100ml棕色量瓶中,用水溶解并稀释至刻度,作为对照品储备液。精密量取对照品储备液1ml,置50ml棕色量瓶中,用水稀释至刻度,即得。

2.2.2 供试品溶液的制备

避光操作。取供试品研细,精密称取4g,置50ml棕色量瓶中,加约30ml水,在超声波水浴中超声提取10min,取出,用水稀释至刻度,混匀,用0.45μm滤膜滤过,取续滤液,即得。

2.3 专属性试验

取空白辅料按配方量称取适量,按“2.2.2”项下方法配制阴性对照溶液。取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液,按“2.1”色谱条件测定,结果表明阴性按HPLC方法操作,记录色谱图,见图1。结果表明,阴性对照液对测定无干扰。

2.4 线性范围考察

对照品溶液

取“2.2.1”项下对照品储备液,分别精密量取0.25ml、0.5ml、1.0ml、2.5ml、4.0ml、5.0ml,分别置50ml量瓶中,用水稀释至刻度,分别进样20 μl ,记录色谱图。以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归,得回归方程:A=1.46×105×C+177.74,相关系数r=0.9999。结果表明,维生素B12在0.5-10μg·ml-1浓度范围内线性良好。

阴性对照溶液

供试品溶液

2.5 检测限

取对照品溶液,定量稀释成系列浓度溶液,照上述色谱条件测定,得检测限为0.06μg/ml(信噪比为3:1)。

2.6 重复性试验

取同一批号的样品6份,按“2.2.2”项下方法配制供试品溶液,照上述色谱条件测定,测得维生素B12含量的RSD=0.98%,重复性良好。

2.7 稳定性试验

取供试品溶液按上述色谱条件测定,分别在0小时、1小时、4小时、6小时各取样20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图。测得维生素B12峰面积RSD=1.8%,结果表明,供试品溶液在室温下避光放置6h稳定。

2.8 回收率试验

取“2.2.1”项下对照品储备液,分别精密量取0.8ml、1ml、1.2ml各三份,分别置50ml量瓶中,并按处方量100%加入辅料,用水稀释至刻度,滤过。照上述色谱条件测定,记录色谱图,计算回收率。结果见表1。

2.9 样品测定

取3批样品,每批称取2份,照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按上述色谱条件测定。结果见表2。

3 讨论

(1)现保健食品中维生素B12的测定是针对多成分,基质相对复杂的样品而制订的。其测定原理是采用固相萃取法对试样提取液中的维生素B12进行富集并去除部分杂质,供高效液相色谱仪分析。该方法前处理复杂,操作繁锁,检测周期长、所使用的部分试剂试药具有毒性(三氯甲烷、四丁基氯化铵),检验成本高。其中经净化步骤的目的在于除去脂溶性干扰物质,如脂溶性维生素、油脂等;固相萃取步骤的目的是将B12进一步提纯、富集到足够的浓度,达到仪器检测的灵敏度。如B族维生素片配方中不含脂溶性成分,且浓度较高,则无需进一步富集纯化即可达到仪器检测的灵敏度。本文中企业提供的样品是由7种水溶性B族维生素与适宜的辅料制成,配方中不含脂溶性成分,维生素B12的含量为15～40mg/100g,故上述方法适用于此类产品的含量测定。

(2)对维生素B12溶液进行紫外扫描,在361nm波长处有最大吸收,故选择361nm为检测波长。

[1]库姆斯,张丹参,杜冠华.维生素:营养与健康基础.第3版.北京:科学出版社,2009:322～323,369,385,449.

[2]GB/T 17819-1999《维生素预混料中维生素B12的测定高效液相色谱法》[S].