叶绿素荧光动力学在植物抗逆性研究中的应用

鲁 松

(四川省自然资源科学研究院，四川 成都 610015)

叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作用。与“表观性”的气体交换指标相比，叶绿素荧光参数更具有反映“内在性”特点。因此，叶绿素荧光动力学技术被称为测定叶片光合功能快速、无损伤的探针。本文简要概述了叶绿素荧光动力学的基本原理及其在植物抗逆性实验中的应用。

1 叶绿素荧光动力学的基本原理

将绿色植物含叶绿素的部分组织，如叶片、芽、嫩枝条、茎或单细胞藻类悬液放在暗处适应片刻，或用近红外光预照射，然后在可见光下激发，并用荧光计检测，结果就会发现植物绿色组织会发出一种微弱的暗红色强度随时间不断变化的荧光信号，这种荧光信号绝大部分是来自叶绿体光系统II(PSII)的天线色素蛋白复合体中的叶绿素a 分子，这过程即为叶绿素荧光动力学。由于这个现象最早是由Kautsky 发现的［1］，因此，它有时也被称为Kautsky效应。

经暗适应的绿色植物样品突然受到可见光照射时，其体内叶绿素分子可在纳秒(ns)级时间内发出一定强度的荧光，此时的荧光称为固定荧光(Fo)，然后荧光强度增加的速度减慢，因而在Fo 处形成拐点，接着以毫秒级速度形成一个缓台阶，数秒后荧光强度可达最高点，称为“P”峰。若所用激发光强度达到或超过被测样品光反应的光饱和点时，P 峰即趋于或等于最大荧光产量(Fm)，Fm可反映通过PSII 的电子传递情况。荧光强度超过Fo 那一部分的荧光称为可变荧光(Fv)。在P 峰之后，植物荧光通常经1次～2次阻尼振荡(称较大蜂“M1”和“M2”)，才降到接近Fo 的稳定的水平。荧光强度下降的过程现称为荧光淬灭。体内叶绿素荧光动力学有两个显著的特点:一是它可将植物发出的荧光区分为性质上完全不同的两个部分——固定荧光(Fo)部分和可变荧光(Fv)部分。固定荧光(Fo)代表不参与PSII 光化学反应的光能辐射部分，也称初始荧光或基础荧光，是光系统II (PSII)反应中心处于完全开放时的荧光产量，它与叶片叶绿素浓度有关;可变荧光(Fv)代表可参与PSII 光化学反应的光能辐射部分。根据可变荧光(Fv)在总的最大荧光(Fm=Fv+Fo)中所占的比例(Fv/Fm)，即可简便地得出植物PSII 原初光能转换效率。Fv/Fm是PSII最大光化学量子产量，反映PSII 反应中心内光能转换效率或称最大PSII 的光能转换效率，在叶片暗适应20min 后测得，非胁迫条件下该参数的变化极小，不受物种和生长条件得影响，胁迫条件下该参数明显下降。另一个特点是，荧光动力学是测定植物从暗中转到光下，其光合作用功能从休止钝化状态转为局部活化状态，直到全部正常运转状态过程中的荧光动态变化，而它包含着十分丰富的光合信息，这远不是一般静态荧光测量所能比拟的。另外，如果叶片不经过暗适应可在光下直接测定实际荧光产量，常用Fv ˊ/Fm ˊ表示PSII 有效光化学量子产量，它反映开放的PSII 反应中心原初光能捕获效率;而(Fm ˊ-F)/Fm ˊ即PSII 实际光化学量子产量则反映PSII 反应中心在有部分关闭情况下的实际原初光能捕获效率［2］。

在体内叶绿素荧光动力学测定中，当样品的叶绿素浓度和荧光计的激发光强恒定时，PSII 原初电子受体QA的氧还状态是决定体内叶绿素荧光强弱的主要因素。当植物经一段时间暗适应，或用优先为光系统I (PSI)所利用的长波光照射后，其体内PSII 的QA和随后的电子受体QB和PQ 库等均完全失去电子而被氧化，这时PSII 反应中心可接受光电子，即处于“开放”状态，这时荧光强度最弱，即为Fo，当植物被饱和光激发，使PSII 电子受体QA、QB和PQ 库等完全被还原时，PSII 反应中心不再接受光电子，即处于“关闭”状态，这时荧光强度最强，即为Fm。植物经短暂照光达到“P”峰后，由于一些光合酶系逐渐被活化，使PSI 开始运转，而将PSII 还原侧的还原态的电子受体和PQH2等再氧化，从而引起荧光强度的淬灭，这称为光化学淬灭(qP)。植物在光的持续照射下，紧接着光化学淬灭的增加，在光合膜的两侧逐渐建立起质子梯度和形成膜高能态，它们也可造成荧光淬灭，这种淬灭称为能量淬灭，或qE 淬灭［2］，另外，当激发能在PSI 和PSII 之间分配变化时，分配给光系统II 的激发能的量降低，这引起的淬灭称为qT，与光合作用的光抑制(photoinhmition)有关的淬灭为qI，这三者造成的淬灭合称非光化学淬灭(qN)。qP 淬灭因为是由等再氧化所造成，因而它与光合电子传递、光合放氧等过程直接相关，反映的PSII 天线色素吸收的光能用于光化学电子传递的份额，要保持较高的光化学淬灭就是要使PSII 反应中心处于“开放”状态，所以光化学淬灭又在一定程度上反映了PSII 反应中心的开放程度，以光化学系数qP=(Fm' -Fs)/(Fm' -F0)表示，qP 愈大，QA—重新氧化形成QA的量愈大，即PSII 的电子传递活性越大。而qN 淬灭因为是由质子梯度和膜高能态等所引起，因而它与ATP 的形成、积累以及与光合膜的状态有关，它反映的是PSII 天线色素吸收的光能不能用于光合电子传递而以热的形式耗散掉的光能部分。非光化学淬灭的计算有两种表示方法［3］，NPQ=Fm/Fm' -1 或qN=1 -(Fm' -Fs)/(Fm -F0)=1 -Fv'/Fv。在植物受到环境胁迫时，PSII 天线色素吸收的过量光能如果不能及时耗散，将对光合结构造成失活或破坏，所以非光合化学淬灭是一种自我保护机制［4］。

2 叶绿素荧光动力学在植物抗逆性研究中的应用

叶绿素a 荧光与光合作用各种反应紧密相关，任何逆境对光合作用某过程的影响都可通过叶绿素荧光诱导动力学反映出来。因此，叶绿素荧光诱导动力学对于研究逆境胁迫对植物的影响具有十分重要的意义。逆境胁迫对植物光合作用的影响是多方面的，不仅直接引发光合机构的损伤，同时也影响光合电子传递及与暗反应有关的酶活性，利用叶绿素荧光动力学方法可以快速、灵敏、无损伤探测逆境对植物光合作用的影响。许多研究表明，逆境胁迫的轻重与Fm/Fo、Fv/Fm、qP、qN 的参数值被抑制的程度之间存在着正相关，Fv/Fo、Fv/Fm 分别代表PSII的潜在活性和PSII 原初光能转化效率，非光化学能量耗散易造成Fo 的降低，而光合机构被破坏又使其升高，所以这些参数的变化趋势可作为植物抗逆的指标。

2.1 光抑制

光抑制是指植物的光合机构所接受的光能超过光合作用所能利用的能量时而引起的光合功能降低。目前，人们对光抑制的机理有两种认识:其一，通过增强非辐射能量耗散来消耗过剩的光能，使光合机构免受破坏(伴随Fo 降低);其二，光合机构的PSII 反应中心受到强光破坏(伴随Fo 上升)。以前认为光抑制是PSII 伤害的同义词，然而现在已证明光抑制也是一种光保护过程［5］，经常用Fv/Fm 来检测光抑制。当植物受到光抑制时，常伴随Fv/Fm 的降低和非辐射能量耗散(热耗散，qN)的增加。热耗散在防御光破坏过程中起重要作用，与热耗散密切相关的调节机制是植物体内叶黄素循环。叶黄素循环存在于所有高等植物、蕨类、苔藓和一些藻类的类囊体膜上。其过程是在抗坏血酸和NADPH2的参与下，紫黄质(V)在几分钟内通过环氧玉米黄质(A)转化为玉米黄质(Z)，提高了玉米黄质水平。而玉米黄质的含量与热耗散有密切的关系。自然条件下，随着光强的增加，玉米黄质的含量提高;当光强下降时，玉米黄质向紫黄质转变。如果通过叶黄素循环的非辐射能量耗散仍不能完全消耗过量的过剩的光能时，剩余的这部分能量有可能形成单线态氧，从而对光合机构造成危害。目前，对抑制异议较大是，光抑制是否伴随着D1 蛋白的净降解。一种观点认为光抑制的原初位置是光系统Ⅱ的反应中心，此处D1 蛋白迅速被损伤发生降解;另一种观点认为光抑制是PSII 本身而不是D1 蛋白［6］。

2.2 低、高温胁迫

温度是决定各种植物在地球上不同地区分布的一个重要因子，高、低温胁迫是经常造成作物减产和限制作物产量提高的一个主要因素。因此，在作物育种中选择具有较强的抗寒或抗高温的亲本，并选育出具有较强的相应抗逆性的新品种，一直是人们追求的目标。

低温胁迫对植物光合作用的影响是多方面的，不仅直接引发光合机构的损伤，同时也影响光合电子传递和光合磷酸化以及暗反应的有关酶系。在低温胁迫下，即使中低光强也会使植物发生光抑制，因此，低温胁迫下qN 降低并且过剩光能主要依赖于叶黄素循环进行调节［5］，同时，在低温胁迫下，叶绿素的光还原活性降低，固定荧光Fo 上升，Fv/Fo 和Fv/Fm 的比值明显降低。Fo 上升，表明PSII 反应中心失活，结合Fv/Fo 和Fv/Fm 降低，则反映出PSII的潜在活性和原初光能转换效率的减弱。

高温胁迫常引起PSII 反应中心的失活和捕光叶绿素a/b 蛋白复合物的降解，其原因是由于PSII捕光叶绿素a/b 蛋白复合物磷酸化所调节的状态1至状态2 转化，这被认为是防御PSII 过量激发或结构损伤的机制。状态1 向状态2 的转化会使PSII获得激发能减少引起荧光淬灭。

2.3 水分胁迫

水分是植物生长发育的必要条件之一，由于干旱胁迫引起的林木、农作物减产的量相当于其他因素引起减产总量的一半［7］。干旱胁迫可导致植物叶片中叶绿素含量的降低，叶片失水影响叶绿素的生物合成，且促进已形成的叶绿素加速分解，造成叶片变黄。而在一定范围内叶绿素含量的高低则直接影响叶片的光合能力，较合理的叶绿素a/b 值可防止叶内光能过剩诱导的自由基产生和色素分子的光氧化。植物受中度以上干旱胁迫后，光合作用受到明显抑制，此时气孔限制不是光合作用降低的主要原因，光合作用的下降主要与叶绿体的功能障碍有关，干旱阻断了放氧复合物到光系统II(PSII)的第二个电子供体(即质子醌和P700)之间的电子传递，从而导致整个电子传递活性降低。PSII 的破坏常伴随Mn2+的丧失，脂肪酸的增加及ATP 和蛋白质的降解［8］。在水胁迫期间如维持正常光照会提高玉米黄质的保护作用，即提高天线叶绿体中热耗散的速率，从而降低PSII 光化学效率(Fv/Fm)。水分胁迫能引起Fo 上升和Fv 下降，他们的变化程度可以用来鉴别植物的不同抵抗或忍耐干旱能力［9］。

2.4 盐胁迫

盐碱胁迫对植物产生的胁迫作用与干旱胁迫有相似的生理效果如:引起植物失水和体内渗透压的增加，除此之外，盐离子代谢失调也会影响光合作用的正常进行。受到盐胁迫的植物，都会有Fv/Fo、Fv/Fm、qP 的下降和qN 的上升，而且非光化学淬灭系数比光化学淬灭系数对NaCl 反应较敏感，这主要是与NaCl 胁迫使叶片中的离子平衡及细胞结构遭到破坏，毒性物质产生，叶绿素活性和光合酶活性下降有关。另外，有报道指出，在叶中同时积累钠和氯会加速荧光的淬灭，若仅积累氯排出钠则不会加速这种淬灭，加速荧光淬灭可能是由于加速QA再氧化的结果［10］。

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