泌尿生殖道支原体培养鉴定方法的分析

陶建萍

（广西梧州市红十字会医院检验科 广西 梧州 543300）

支原体是一种能独立生活，介于细菌与病菌之间最简单的原核生物。有80多种广泛分布于自然界，目前已知人类支原体有十多种［1］。近年来支原体已广泛成为非淋病泌尿生殖道感染的主要病原菌［2］，因其传播快，范围广，已成为世界备受关注的公共卫生问题［3］。从十九世纪六十年代开始至今，欧美国家就从支原体的生物学特性，培养，药敏，等方面展开了广泛的研究。进十年来，我国对支原体的流行病学和耐药性等方面也进行了大量的文献报告，在这些报道中［4］－［9］发现支原体分离培养，鉴定方法均普遍 存在着一些问题［10］，其中比较多的是单凭肉汤培养颜色的变化来判断有无支原体生长，而不是根据支原体在固体培养基上的典型菌落来判断有无支原体，这就容易受到其他因素干扰，导致支原体培养鉴定假阳性和假阴性。本文综合有关文献报道就支原体生物学特性，培养特性，国内外支原体培养的方法，肉汤培养液颜色及支原体假阳性的问题进行探讨。

1 常见生殖道支原体

人类生殖道支原体最常见的有解脲支原体（Uu），人型支原体（MH），生殖道支原体（MG）发酵支原体［11］。致病性较强的主要是Uu和MH。解脲支原体长居在人的泌尿生殖道黏膜，引起成人的泌尿生殖系统炎症反应和结石，各种慢性急性妇科炎症，男女不育症，孕妇早产和男性慢性前列腺炎［12］。

2 生物学特性

解脲支原体（Uu）在固体培养基上菌落表面有粗颗粒，在适宜培养基中可转呈光滑，并发育成典型的‘荷包蛋’状菌落，不被青霉素抑制，对红霉素高度敏感，支原体营养要求高于一般细菌，支原体在生长过程中可分解尿素。

3 支原体培养特性

支原体的特征是不具有细胞壁，能通过除菌滤器，能在人工培养基上生长，但营养条件高，培养需要供给胆固醇和新鲜酵母侵膏，同时还要添加少许鸡蛋清或马血清［13］。支原体培养基一般有三种：转运培养基，肉汤增菌培养基和琼脂固体培养基。

4 支原体培养及鉴定方法

追根溯源，从支原体培养的最初研究开始，支原体的鉴定就是依据琼脂固体培养基上的典型菌落形态和生化反应，在美国支原体培养鉴定按《临床生物手册》［14］依据固体培养基上的固形菌落形态的生化反应鉴定支原体。国内1997年《全国临床检验操作》第二版和曹三璞主编《支原体与支原体病》等国内相关权威性专业书籍中介绍支原体培养方法同样包括肉汤增菌和转种固体平板两部分鉴定支原体。因此，无论国内外判断支原体阳性结论最终建立在培养基的典型菌落。完整的支原体培养过程应有两步，第一步肉汤增菌观察颜色变化，第二步将增菌培养液转琼脂固体培养基观察其典型菌落形态，最终准确可靠的鉴定应当依据菌落形态和有关生化鉴定。

目前国内支原体检测方法有固体培养基培养法，血清学试验检测法，分子生物学方法及支原体液体培养法等。

4.1 支原体固体培养法：固体培养法是标准的支原体培养法，固体培养基中加有马血清、0.05%新鲜酵母浸膏、0.02%酚红和抗生素。将接种好标本的固体培养基置95%N2和5%CO2环境，35℃温箱16－24小时培养形成细小典型的“荷包蛋”状菌落。固体培养方法好，特异性高，但需要培养条件高，受局限性，培养基配制繁琐，生长慢，采用滤膜易受污染［15］，同时存在所需配套设备多，技术要求高等缺点不利于临床推广。此方法广泛应用于研究所、实验室。目前国内有条件的实验室已用法国生物梅里埃A7琼脂平板固体培养基检测支原体。

4.2 血清血试验诊断：包括：①斑点免疫结合试验。②间接血凝试验（IHA）。③代谢试验（MIT）。④酶联免疫吸附试验（ELASA）。斑点免疫结合试验，此方法简单，但敏感度低，可能漏检；间接血凝试验（IHA）、代谢试验（MIT）、酶联免疫吸附试验等三种方法有较强的敏感性，缺点是操作较繁琐费时，需要大量血清，结果不稳定，试剂不易获得。

4.3 分子生物学方法：解脲支原体检测的分子生物学方法包括：①聚合酶链反应（PCR）。②荧光PCR（FQ－PCR）。PCR用于检测解脲支原体DNA，具有可定性和定量、敏感度高、结果比较客观的优点，但无法提供药敏试验，易受其他因素影响，稳定性和特异性不足，实验室设施要求高；荧光PCR（FQ－PCR）技术特异性和敏感性菌较高，亦存在一定假阳性，需要荧光定量测定仪，价格高，实验室设备要求高，一般临床实验室开展有一定难度。支原体培养法与PCR、FQ－PCR检测结果对比：支原体培养法的特异性100%，但敏感性低，只有71.43%；PCR的敏感性为96.43%，但特异性稍不足，为93.7%；FQ－PCR的敏感性是三种方法中最高的99.2%，特异性为99.2%。FQ－PCR技术融合了PCR的高敏感性、特异性强、准确性好；试验周期快，且能准确定量，对早期诊断及疗效的检测有一定临床价值，但PCR和FQ－PCR检测需要特殊仪器和专业工作人员，较难在基层推广。

4.4 支原体培养液法：目前国内医院临床试验普遍采用支原体液体培养基进行分离和鉴定，支原体在液体中生长具有与细菌不同的特点。该检验方法简单，快捷，经济，敏感性好。其检验原理是依据解脲支原体能分解尿素，人型支原体能分解精氨酸，均能产氨使液体培养基变碱性。所有商品化中成品支原体培养液肉汤都依据此原理设计，在肉汤中加入酚红指示剂，当尿素或精氨酸被分解成NH3时肉汤PH值上升，含酚红指示剂肉汤由橘黄色变红色判断为Uu和MH阳性［16］。但结果易受其他因素干扰，如标本污染产尿酶细菌就会产生假阳性。常规支原体液体培养液中的抑制剂为青霉素，以抑制标本中杂菌，但抑制剂不能抑制所有微生物。一旦有其他能分解尿素和精氨酸的微生物在培养基中生长，就会导致假阳性或假阴性，仅靠肉汤颜色变化判断支原体阳性，不客观，肉汤颜色变化只是一种提示和初筛。在检测标本中如果有较高比例的细菌生长，肉汤变浑浊或消耗肉汤中营养成分，造成假阳性和假阴性，影响结果的真实性［17］。建议有条件实验室检测解脲支原体和人型支原体，以观察肉汤颜色变化和支原体同时固体培养鉴定最佳。

综上所述，FQ－PCR是一种比较理想的支原体检测方法，优于支原体液体培养法，有较大的临床应用价值和推广价值。FQ－PCR法特异性好，敏感性好，而且能准确定值，近年来特别在诊断新生儿痰液中解脲支原体的临床意义较大，可观察新生儿解脲支原体感染高低值，对诊断新生儿解脲支原体感染有临床指导意义，但不能同时检测支原体体外药物敏感性，而且检测设备要求高，基层难推广。固体培养基培养法被普遍认为是支原体检测的“金标准”，目前无论是国外，还是国内判断支原体阳性的结论都是建立在固体培养基上的典型支原体菌落，该方法值得推广。国内目前已有用法国梅里埃A7琼脂平板固体培养基法检测支原体的有关报道，值得普及。液体培养法操作简单，不要特殊条件，容易在基层普及推广，结果容易判断，可以同时进行药敏试验，指导临床合理使用抗生素，但容易受外界因素干扰，特异性较差，当标本混合有可分解脲酶的微生物液体培养基就会变红产生假阳性和假阴性。至今没有一种检测技术的同时有100%的敏感性和特异性。建议医院临床实验室在采用支原体液体培养时，增加细菌分离鉴定及细菌脲酶试验，最好用固体培养法提高支原体的特异性，用液体培养法初筛并进行药敏试验，即可排除产脲酶细菌引起的假阳性，假阴性，又提高支原体培养的特异性和敏感性，保正结果准性，具有较好的临床应用价值，值得临床推广应用。

［1］ 张道友主编.先化临床试验正常值手册［M］.安徽科学技术出版社，2001：405

［2］ 王矽，宋新丽，李泽，等.泌尿生殖道感染支原体耐药分析［J］.中华微生物和免疫学杂志，2002，22（4）：405－406

［3］ 李跃进，谭湘芳.荧光定量PCR检测性病的结果分析［J］.实用医技杂志，2007，6（14）：2151

［4］ 张子平，施透明，刘 等.非淋菌性尿道（宫颈）泌患者解脲支原体和人型支原体的培养分析［J］.福建医科大学学报，2002，.34（2）：183－184

［5］ 王莉平，资捷，易辉.女性泌尿生殖道感染患者解脲支原体和人型支原体培养及耐菌性分析［J］.中华医院感染学杂志，2007，31（5）：612－614