运用组织工程技术修复眼表损害的研究进展

张毓敏

(武警北京总队三师第二支队卫生队100081)

正常的眼表是由结膜和角膜上皮组成的，这两种上皮具有不同的细胞表型。其中，完整的角膜上皮对维持角膜的屏障功能，屈光功能及透明性起着关键作用。角膜上皮是一种能够不断自我更新的组织，其完整性的维持依赖于角膜缘干细胞的不断增殖［1］。同时，角膜缘作为一种屏障可阻止结膜血管侵入，对角膜透明状态及其正常视功能的维持具有重要意义。当角膜的完整性遭到化学伤及热烧伤、辐射损伤、微生物感染等因素的破坏以致角膜缘干细胞严重缺乏或功能障碍时，会出现角膜的"结膜化":结膜上皮增生移行、角膜上皮持续缺损、基质瘢痕、新生血管形成、杯状细胞出现，对患者视力造成严重的威胁。为了挽救上述严重的眼表损害，研究者已经尝试多种方法进行眼表重建。

1.眼表损害既往治疗方法

(1)自体组织移植:①结膜移植术:通过自体结膜移植修复单侧眼化学伤;②角膜缘移植术:采用自体的角膜缘组织进行移植，取得很好的疗效。但由于自体组织取材量有限，故仅适用于单眼或双眼局限性角膜缘受损的病例。而且健康组织缺损引起的损害亦不能忽视，所以这并不是最佳的治疗方法。

(2)同种异体组织移植:由于异体角膜缘移植术存在排斥反应而限制了其运用。此外，角膜缘移植的成功率还取决于角膜基质的微环境。虽然这一疗法克服了自体组织移植的供量有限等缺点，但由于移植后的免疫排斥反应尚不能完全克服，需长期使用免疫抑制剂，再加上供体来源的限制，以及医学伦理学方面的障碍，至今尚未能广泛用于临床。

2.组织工程学在眼科学的应用及进展:运用组织工程技术制备工程化角膜上皮为眼表损害的治疗带来了新的思路。将活细胞与可降解支架材料结合，在体外构建有生命的种植体，植入体内修复组织缺损，重建功能，以达到治疗疾病目的的一门新兴学科［3－4］。

(1)组织工程角膜上皮

1)通过体外培养扩增的方法获得足够量的种子细胞，种植于一种生物相容性良好的载体上复合成组织工程化角膜上皮，移植到患者眼表治疗眼表损害。理想的种子细胞应有较强的增殖能力且能长期保持其特有的生物特性。目前主要有三个来源:角膜缘干细胞、胚胎干细胞和非眼表来源的上皮细胞。除了理想的种子细胞外，合适的支架材料也是组织工程化角膜上皮构建成功的关键。材料必须满足以下几点:①自身及其降解产物对机体无毒性;②具有优良的生物相容性和组织相容性;③不引起排斥反应和炎性反应;④在机体内可逐渐降解吸收，降解和吸收的速度与组织细胞的生长繁殖速度相匹配。目前用于组织工程化角膜上皮的支架材料主要分成天然载体和人工合成载体两类。天然载体包括羊膜，角膜基质，胶原等。人工合成载体包括聚乳酸(PLA)和聚羟基乙酸(PGA)、纤维蛋白等。

随着对羊膜基础研究的深入和显微手术技术的提高，羊膜广泛应用于临床眼表重建中。研究表明，羊膜在移植术后通过一些生长因子如:皮生长因子(EGF)，角化细胞生长因子(KGF)，肝细胞生长因子(HGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等促进上皮增生分化。

羊膜具有抑制血管内皮细胞的迁徙和生长的作用，从而抑制了角膜新生血管的发生。此外，羊膜材料易获得，免疫原性低，具有抗微生物的特性和较强的抗粘附性，还可作为理想细胞载体。正是因为上述优点，羊膜已用于多种眼表疾患的治疗和重建术中角膜上皮的缺损。近年来将角膜缘干细胞等种子细胞培养在羊膜上构建羊膜角膜植片用于治疗角膜缘干细胞缺失已有成功的报道并成为目前研究的热点。

2)种子细胞构建组织工程化角膜上皮一个必要条件是理想的种子细胞。随着对角膜缘干细胞研究的不断深入，以角膜缘干细胞为种子细胞构建组织工程化角膜上皮的技术已经比较成熟［2］。1997年，Pellegrini等［3］首次应用角膜缘干细胞体外培养构建角膜上皮组织对2例碱烧伤患者施行自体移植，随访2年，重建的角膜维持稳定、透明，组织无血管化。Schwab［4］将自体角膜缘干细胞体外培养扩增后，种植于羊膜上构建角膜上皮，回植治疗19例严重眼表皮损伤患者，效果良好。以LSCs作为种子细胞联合适宜载体的移植术，在很大程度上解决了角膜移植材料不足的问题，而且大大降低了移植排斥反应的发生，是治疗干细胞缺乏的眼表疾病最有吸引力的方法之一。但是，这一治疗手段不适用于那些双眼严重受损，不存自体角膜缘移植来源的患者［5］。因此，许多研究者开始尝试其他来源的细胞。这些细胞包括胚胎干细胞、口腔上皮细胞、骨髓干细胞等［3］。

胚胎干细胞(ESC)来源于早期胚胎的多能干细胞，是一种体外培养时能维持正常核型，在一定条件下能诱导分化成各系统细胞的高度未分化细胞。ESC系确立，为许多组织器官的移植提供了可能，选取适宜载体利用胚胎干细胞作为种子细胞诱导分化为角膜缘干细胞或角膜上皮细胞已实现了实验性的眼表重建。

口腔粘膜上皮细胞作为种子细胞治疗眼表疾病已成为研究热点。Nakamura等［6］将取自兔的口腔粘膜上皮细胞以羊膜为载体，进行体外培养2～3周，组织学检查发现经培养的兔口腔粘膜上皮细胞复合物有4～5层的复层上皮细胞、分化良好，外观上与正常角膜上皮细胞相似。免疫组化分析显示培养的口腔上皮细胞表达角膜特异性的角蛋白，具有非角化上皮的特征。电镜观察显示以羊膜为载体培养的口腔上皮细胞具有与角膜上皮细胞相似的半桥粒，桥粒等对维持角膜上皮正常功能非常重要的特异性连接结构。故采用体外培养口腔粘膜上皮细胞作为种子细胞来重建眼表，是治疗严重眼表疾病的新途径之一。

(2)应用:自体来源细胞构建组织工程化角膜上皮可以避免异体移植的免疫反应;且由于细胞经体外扩增，因而取材量较小，对同侧眼的健侧象限或对侧健眼不会造成较大的损伤。1997年，Pellegrini等［7］首次应用角膜缘干细胞体外培养构建角膜上皮组织对碱烧伤患者施行自体移植，随访2年，重建的角膜维持稳定、透明，无血管化。随后，Schwab［8］报道了将自体角膜缘干细胞体外培养扩增后，种植于羊膜上构建角膜上皮，回植治疗19例严重眼表损害患者，效果良好。Tsai等［9］以羊膜为载体构建组织工程化角膜上皮移植片进行眼表重建也获得成功。Nishida等［10］将自体口腔粘膜上皮细胞体外培养移植重建眼表，发现术后一周所有患者角膜荧光素染色阴性、角膜恢复透明。在随访期14个月内，角膜上皮保持稳定并透明。

(3)可行性:以上皮细胞作为种子细胞治疗眼表疾病已成为研究热点。与表皮角质化细胞相比，自体上皮细胞处于较低的分化阶段，体外培养时间较短，能够较长时间维持非角化状态。此外，角蛋白K3是角膜分化形态的可靠标志物，而研究发现体外培养正常上皮细胞也表达该蛋白。免疫组化分析显示培养的上皮细胞移植片表达角膜特异性的角蛋白K3，具有非角化上皮的特征。超微结构方面，电镜观察显示以羊膜为载体培养的上皮细胞具有与角膜上皮细胞相似的半桥粒，桥粒等对维持角膜上皮正常功能非常重要的特异性连接结构。以上特征说明了体外构建组织工程角膜上皮移植片为角膜上皮理想替代物用于眼表重建的可行性。

3.问题与展望:组织工程技术的发展，为治疗严重眼表损害提供了新的思路。对各种眼表损害来说，运用羊膜构建角膜上皮移植片修复眼表是一种新的可行的治疗方法。相比于异体角膜移植来说，避免了术后长期应用免疫制剂所产生的并发症。然而，上皮细胞组织工程化角膜的研究尚处于起步阶段。在双眼干细胞缺失的情况下，用自体上皮细胞进行眼表重建短期效果理想，但上皮细胞属于成体细胞，终究会凋亡。这就对应用上皮细胞进行眼表重建的长期效果和可行性提出了挑战。此外，上皮细胞在载体上的固定、细胞的鉴定，以及影响上皮细胞体外培养分裂，增殖的因素等问题仍需要进一步研究以明确。但相信随着各项工作的不断深入，这些问题都会得到解决。

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2 Tsai RJ，Tseng SC.Human allograft limbal transplantation for corneal surface reconstruction［J］.Cornea，1994，13(5):389－400.

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5 Dua HS，Azuara－BlancoA.Autologous limbal transplantation in patients with unilateral corneal stem cell deficiency［J］.Br JOphthalmol，2000，84(3):273－278.

6 Nakamura T，Kinoshita S.Ocular surface reconstruction using cultivated mucosal epithelial stem cells［J］.Cornea，2003，22(7):75－80.

7 Pellegrini G，Traverso CE，Franzi AT，et al.Long－term restoration of damaged corneal surfaces with autologous cultivated corneal epithelium［J］.Lancet，1997，349(9057):990－993.

8 Schwab IR，Reyes M，Isseroff RR.Successful transplantation of bioengineered tissue replacements in patients with ocular surface disease［J］.Cornea，2000，19(4):421－426.

9 Tsai RJ，Li LM，Chen JK.Reconstruction of damaged corneas by transplantation of autologous limbal epithelial cells［J］.N Engl JMed，2000，343(2):86－93.

10 Nishida K，Yamato M，Hayashida Y，et al.Corneal reconstruction with tissue－engineered cell sheets composed of autologous oralmucosal epithelium［J］.N Engl JMed，2004，351(12):1187－1196.