TACE激酶在猪排卵过程中的作用机制

王亚磊，茆达干

（南京农业大学动物科技学院，南京 210095）

脑垂体分泌的促黄体素（LH）可以刺激排卵前卵泡，诱导排卵过程：包括卵泡壁的破裂，颗粒细胞黄体化，卵丘扩展以及卵母细胞减数分裂的成熟。LH 受体主要在颗粒细胞中表达，颗粒细胞黄体化水平过高时受体即降解，因此，可能需要其它潜在因子与颗粒细胞、卵丘细胞或卵母细胞互作诱导排卵过程的进行。Conti 等通过研究PMSG 与hCG 刺激的小鼠卵巢颗粒细胞mRNA表达图谱，发现hCG 作用后的EGF 样因子、双调蛋白(AREG)、表皮调节素（EREG）和β-动物纤维素(BTC)表达量明显升高，应用这些因子体外培养能加强卵丘细胞的扩展以及小鼠卵母细胞减数分裂的成熟。EGF 样因子作用于EGFR，激活颗粒细胞和卵丘细胞中的Ras-MAPK1/3 通路，而含该通路下游基因Erk1/2 突变的干扰卵母细胞的成熟、卵丘的扩展和颗粒细胞黄体化则会受到抑制，因此，EGF 样因子可能是颗粒细胞自分泌的关键调节因素之一，使LH 依赖的颗粒细胞信号转向卵丘细胞和卵母细胞。EGF 样因子是含有一个信号序列、一个跨膜区域和至少一个EGF 区域的跨膜蛋白。金属蛋白酶作用于EGF 区域，使EGF 样因子作为配基激活同源受体。肿瘤坏死因子α-转运酶（TACE），又称为ADAM17，是ADAM 蛋白酶家族成员之一。Sahin等证明TACE 是小鼠胚胎细胞AREG和EREG 主要蛋白脱落物。TACE 在心脏、大脑、肺、肝脏、肌肉、肾脏和睾丸中均有表达。EGF 样因子在排卵过程中的表达机制已被报道，但这些因子如何被特异性激活为配基，尤其是关于TACE/ADAM17的表达和功能还未见报道。本文介绍了TACE/ADAM17的表达和激活机制以及在猪卵母细胞成熟过程中颗粒细胞和卵丘细胞内的生理功能。

1 TACE/ADAM17在猪颗粒细胞和卵丘细胞中的表 达

TACE/ADAM17属于去整合素和金属蛋白酶（A Disintegrin And Metalloproteinase,ADAM）蛋白家族成员，该家族包含30 多种蛋白质，其中约50%主要在睾丸中表达，调控精子发生过程，其他成员主要在神经发生、肌生成、骨生成和免疫调节中发挥作用。与其他ADAM 蛋白家族不同，TACE/ADAM17mRNA 主要在免疫组织中表达，在癌细胞中高量表达，参与激活EGFR-MAPK3 通路从而引起癌细胞增殖和迁移。排卵过程中EGF 样因子的表达可以短暂显著地激活颗粒细胞和卵丘细胞中EGFR-MAPK3/1 通路。因此可推测在排卵过程中TACE/ADAM17可能作为EGF 样因子的脱落酶在颗粒细胞和卵丘细胞中表达。

应用eCG/hCG 预处理的猪有腔卵泡、排卵前卵泡和接近排卵的卵泡中颗粒细胞和卵丘细胞TACE/ADAM17mRNA 表达出现短暂变化。进一步研究结果显示，单独应用eCG 来诱导卵泡发育到排卵前阶段，颗粒细胞和卵丘细胞中TACE/ADAM17mRNA 的表达水平并没有增加，然而再由hCG 刺激时mRNA 表达显著增加。

为了阐明TACE/ADAM17如何在排卵过程中的表达，应用体外颗粒细胞和卵丘卵母细胞复合体（COCs）培养实验，发现FSH 和/或LH 处理可以增加这2 种细胞TACE/ADAM17mRNA 的表达水平，从而导致Areg 和Ereg mRNA 的表达量增加。Western Blotting 结果表明COCs 的卵丘细胞内FSH 和LH 诱导的蛋白表达量亦有增加。研究还发现，TACE/ADAM17的表达量可被PKA、p38MAPK 或MAPK3/1 通路的抑制剂抑制。TACE邻近的启动子包括大量的AP2 和Sp1转录因子结合位点，并且包含一个GC框 和 一 个CCAAT 框（MAPK3/1 的靶位点）。C/EBPα 和C/EBPβ 可以直接结合到启动子区域的CCAAT 框，但是它们亦可被PKA 和p38MAPK 通路激活。小鼠的颗粒细胞LH 刺激可迅速激活PKA 和p38MAPK 通路，然后EGF 样因子的表达诱导MAPK3/1的磷酸化。因此，PKA 和p38MAPK激活的TACE/ADAM17表达可以释放EGF 样因子的EGF 区域，进而增加MAPK3/1 的磷酸化水平。MAPK3/1-C/EBP 通路可以进一步增加TACE/ADAM17的表达水平从而维持信号通路的激活状态。

2 TACE/ADAM17在猪颗粒细胞和卵丘细胞中的功能

已经报道的TACE/ADAM17在许多组织和细胞类型中的可能基质包括转移生长因子α（TGFα），肝素结合表皮生长因子（HB-EGF），Notch，Areg 和Ereg。 小 鼠 卵 巢TGFα 和HB-EGF 低量表达，并且在卵泡发育和排卵过程中表达量没有变化，表明这些因子不是TACE/ADAM17的潜在靶蛋白。Johnson 等报道了生长卵泡中作用于PMSG 的Notch mRNA，但Notch 在卵母细胞成熟过程中的作用未被证实。

在排卵过程中Areg 和Ereg 在颗粒细胞和卵丘细胞中表达，它们随着TACE/ADAM17mRNA 的表达水平增加而诱导，表明Areg 和Ereg 可能是接近排卵卵泡中TACE/ADAM17的生理基质。应用促性腺激素培养猪COCs 40 h 能 增 强TACE/ADAM17酶的活性。EGF 或促性腺激素诱导COCs 的卵丘细胞中MAPK3/1 的磷酸化。TACE/ADAM17的选择抑制剂TAPI-2 降 低FSH 和LH 诱 导 的 猪COCs 或颗粒细胞MAPK3/1 的磷酸化水平。然而，在EGF 样因子诱导培养的COCs 或颗粒细胞中这些抑制效应就不存在。此外，在大鼠的颗粒细胞，LH 诱导的MAPK3/1 的磷酸化可被TACE/ADAM17干 扰RNA 的 转 染 所抑制。因此，在颗粒细胞和卵丘细胞中TACE/ADAM17的表达可能促进EGF样因子EGF 区域的释放，从而激活在排卵过程中的颗粒细胞和卵丘细胞中EGFR-MAPK3/1 通路。

3 猪COCs的卵丘细胞中EGF样因子、TACE/ADAM17 和PGE2的正反馈调节

排卵前卵泡的卵泡液中含有大量的前列腺素E2（PGE2）。敲除Ptgs2（编码环氧化酶2，COX-2）或Pger2（编码PGE2 受体2，PGER2）的小鼠表现为卵母细胞排出数量减少，受精能力降低。先前的研究表明Ptgs2 敲除的小鼠在施加hCG 过程中EGF 样因子的表达量减少，而EGF 样因子又会使Ptgs2的表达量增加，表明在排卵过程中EGF样因子与PGE2 之间存在正反馈系统。

对猪的COCs 进行体外培养实验， 由FSH 诱 导Ptgs2 和Ptger2 的表达进而引起Areg、Ereg 和TACE/ADAM17的表达。利用PTGS2 的抑制剂NS398 培养COCs 10 h，显著降低卵丘细胞中Areg，Ereg 和TACE/ADAM17的表达量，但是培养5 h 的细胞没有变化。猪的COCs 体外培养成熟过程中，cAMP 水平5 h 内显著增高，一直持续到40 h。然而，单独用FSH培养的COCs 的卵丘细胞中，编码FSH 受体的Fshr 基因表达水平显著性降低，这表明增加卵丘细胞中cAMP 水平的其他刺激物是由卵丘细胞分泌的。通过NS398 培养5 h 时cAMP 水平没有发生变化，而培养10 h 就会明显降低，且显著抑制MAPK3/1 通路。在猪和小鼠中，单独添加PGE2 会诱导卵丘扩展，卵母细胞减数分裂的成熟，表明PGE2 是作用于卵丘细胞维持cAMP水平的第二因子。结果表明EGF 样因子和TACE/ADAM17的最初表达是促性腺激素依赖性的，然而EGF 样因子和TACE/ADAM17的持续表达依赖于PGE2-PGER2 通路。

4 猪COCs的卵丘细胞中PGR通路调控TACE/ADAM17的末端表达

敲除Nr3c3 基因（编码孕酮受体，PGR）的小鼠不能排卵，然而这些小鼠卵巢的组织学分析表明注射hCG 后卵丘会正常扩展。另一方面，猪的COCs体外培养成熟过程中PGR 的药理抑制物或孕酮产物会显著抑制卵丘的扩展和卵母细胞的成熟。另外，单个COC 培养时，卵母细胞减数分裂的起始阶段相对于20 个COCs 一起培养时明显会被推迟。介质中孕酮的含量随每孔COCs数的增加而增加，表明孕酮-PGR 通路至少会影响体外培养的猪COCs 中卵丘的扩展和卵母细胞的成熟。

为了确定孕酮-PGR 通路的作用， 进 一 步 对EGFR-MAPK3/1 通路进行了研究发现，添加PGR 的抗性剂RU486 不影响FSH 诱导的Areg和Ereg 在任何培养阶段的表达，也不会影响培养20 h 的COCs 的卵丘细胞 中TACE/ADAM17mRNA 的 表达，但会明显抑制培养30 h 和40 h 的TACE/ADAM17mRNA 的表达，培养40 h 时MAPK3/1 的磷酸化水平以及靶基因（Fas2 和Tnfaip6）的表达被显著性抑制。此外，卵丘的扩展和达到减数分裂MII 阶段的卵母细胞百分率也会被RU486 抑制。这些结果表明，孕酮-PGR 通路在卵丘扩展过程后期调节TACE/ADAM17的表达，但不影响EGF 样因子水平，这对猪的卵丘扩展和卵母细胞减数分裂成熟过程中EGF 样因子的末端分泌是很重要的。然而，由于TACE/ADAM17基因的启动子区域并不包含孕酮应答元素（PRE），因此，孕酮-PGR 通路怎样调节末端的TACE/ADAM17基因表达需要进一步研究。

5 结论

EGF 样因子是促进卵母细胞成熟和排卵的重要因子。通过TACE/ADAM17释放EGF 样因子的EGF 区域导致EGFR-MAPK3/1 通路的激活，从而诱导猪的COCs 中卵丘的扩展和卵母细胞的成熟。

略)