鼻咽癌相关固有免疫分子及其潜在临床转化前景

梁 芳，曾朝阳，李桂源

鼻咽癌是鼻咽部常见恶性肿瘤，据世界卫生组织统计，80%的鼻咽癌发生在中国，因此被西方学者称为“中国癌”。鼻咽癌由于其发病部位隐蔽，早期症状不明显，容易被人忽视，常常延误诊断;一经发现往往已处于中晚期，耽误最佳的治疗时机，治疗效果不佳。因此，寻找鼻咽癌早期诊断和预警的分子靶标并开发相应的临床诊断和预警试剂盒是鼻咽癌转化医学研究领域的一个重要研究方向。

鼻咽部由于与外界直接相通，长期受各种外来的化学物质刺激，同时温暖湿润的环境适于各种微生物的生长，是病原微生物(包括细菌、病毒等)侵入机体的重要门户。鼻咽癌病因学研究表明，外来因素(特别是致癌微生物的刺激)导致的慢性炎症是鼻咽癌发病的重要诱因，因此机体免疫系统在鼻咽癌早期的调控过程中起到了重要作用。

本课题组在国家重大科学研究计划及多项国家自然科学基金项目资助下，运用基因组学、转录组学、蛋白质组学等高通量技术对不同分化阶段、不同组织类型和不同临床分期的鼻咽癌标本进行大规模筛选，发现鼻咽上皮分泌的固有免疫分子——腭、肺及鼻咽上皮克隆(palate，lung and nasal epithelial clone，PLUNC)蛋白家族[1]和乳转铁蛋白(lactotransferrin，LTF)[2]是鼻咽上皮抵抗微生物感染第一道防线的重要组成部分，它们通过特定的信号转导通路影响鼻咽癌的发生、发展，同时也可作为鼻咽癌早期诊断与干预的重要分子靶点。

1 PLUNC蛋白家族

本课题组通过抑制性消减杂交联合cDNA微阵列技术，克隆了鼻咽组织相对特异性表达基因SPLUNC1和LPLUNC1[3]。它们均属于PLUNC 蛋白家族，是一种分泌性的蛋白质，集中表达在鼻咽、口腔、鼻腔、呼吸道及消化道[1，4]。本课题组通过全基因组表达谱芯片及大样本组织芯片证实在鼻咽部中度炎症时鼻咽黏膜表面分泌物中PLUNC蛋白含量已经显著降低，在癌前病变中进一步下降，在鼻咽癌早期PLUNC蛋白已经检测不到，因此PLUNC是一个非常灵敏和特异的鼻咽癌早期预警信号之一，可作为监测鼻咽癌发生的分子标记物[5-6]。针对该蛋白家族，本课题组已经成功研发了鼻咽癌早期诊断试剂盒，并已经获得了国家发明专利授权[7]。该试剂盒只需获取受检者少量的鼻咽部分泌物就可以检测，无创、无痛、检测简便、成本较低，用于在健康体检中进行鼻咽癌高风险人群筛查具有极为广阔的应用前景;如能推广应用，可以达到鼻咽癌的极早期预测和判断，大大提高鼻咽癌的早期检出率;而鼻咽癌如果能早期发现，治疗效果较好，患者预后比较理想。此外，本课题组在大量鼻咽癌病例中对放疗后PLUNC蛋白水平与放疗后患者生存率的关系进行分析，发现PLUNC蛋白表达水平与鼻咽癌患者治疗后预后密切相关，可作为预测鼻咽癌患者放疗后预后的可靠指标之一。

PLUNC蛋白家族均包含杀菌渗透增强蛋白/脂多糖结合蛋白(bactericidal permeability-increasing protein/lipopolysaccharide-binding protein，BPI/LBP)结构域，其中 LPLUNC1含有2个 BPI结构域，而SPLUNC1只含有1个BPI结构域。本课题组已经通过实验证实了PLUNC蛋白家族具有广谱的杀灭细菌和病毒的能力，参与了机体固有免疫应答反应过程，对鼻咽部和上呼吸道黏膜抵抗外来细菌和病毒的侵袭具有非常重要的作用。重组PLUNC蛋白能与细菌脂多糖结合，杀灭或抑制细菌的生长。对于鼻咽癌重要致瘤病毒——EB病毒，PLUNC蛋白能够促进EB病毒感染的细胞凋亡，抑制EB病毒致瘤蛋白 LMP1的表达，促进EB病毒包膜糖蛋白gp350/220复合体表达，从而启动补体途径对EB病毒进行识别清除，或直接破坏EB病毒的完整性等途径抑制EB病毒的致瘤作用[6]。

2 乳转铁蛋白

本课题组利用湖南鼻咽癌高发家系，通过连锁分析，首次发现染色体3p21部分区域与湖南家族性鼻咽癌发病紧密连锁[8]，单体型分析将湖南家族性鼻咽癌易感基因定位于该染色体区段中约13.6 cm范围内。随后，通过基于家系的传递不平衡分析对上述连锁分析结果进行了确证[9]。发现染色体3p21这一新的鼻咽癌易感基因区后，利用基因芯片技术对位于该区域的所有基因在较大样本鼻咽癌和正常鼻咽上皮组织中进行了较系统的表达谱分析，以筛选该染色体区域的鼻咽癌易感基因候选者，发现乳转铁蛋白(lactotransferrin，LTF)基因表达下调最为显著[10-11]。随后，我们自制的含976个组织点(包含正常鼻咽上皮、鼻咽癌及癌旁组织)的组织芯片[12]对以上筛选出的候选易感基因进行大样本免疫组化和原位杂交验证，证实乳转铁蛋白为细胞分泌性蛋白，在鼻咽癌癌旁和鼻咽慢性炎症组织中高表达，而在鼻咽癌组织中低表达或者不表达。

乳转铁蛋白又名乳铁蛋白(lactoferrin，LF)，属于转铁蛋白家族，是一种非血红素类的铁结合糖蛋白，主要由黏膜上皮细胞和多形核淋巴细胞产生，并分泌到乳汁、唾液、泪液、胆汁、胃肠液、气管和鼻咽腔分泌物、生殖道分泌物和血浆中，其中以乳汁中的含量最高。乳转铁蛋白的生理功能广泛，包括维持铁稳态、预防病原微生物感染和抑制过度炎症反应等，是机体免疫防御系统中的重要天然免疫分子之一。

本课题组研究发现鼻咽癌患者乳转铁蛋白的表达下调与其血清中EB病毒壳抗原IgA(virus capsid antigen-IgA，VCA-IgA)抗体滴度呈负相关[13]，推测乳转铁蛋白表达缺失或下调增加了EB病毒感染的概率。进一步通过激光共聚焦显微镜观察及免疫共沉淀实验证实LTF能与B细胞上的EB病毒受体CD21分子结合，阻断B细胞上的EB病毒结合位点，从而阻止EB病毒吸附并进入B细胞。同时，利用B细胞与上皮细胞共培养系统，发现LTF确实可抑制EB病毒由B细胞向上皮细胞的传递[14]。此外，LTF还能够降低Toll样受体9(Toll-like receptor 9，TLR9)对EB病毒DNA的识别能力，抑制核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)通路的激活，减轻EB病毒诱导的炎症反应。

本课题组研究发现LTF可以抑制鼻咽癌细胞的生长，将细胞周期阻滞于G0～G1期，能负调控丝裂酶原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路的c-jun氨基末端激酶2(c-jun N-teuninal kinase 2，JNK2)和细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)，下调 cyclin D1和phos-RB，上调p21、p27。这说明LTF通过调控细胞周期和MAPK信号传导通路抑制鼻咽癌细胞增殖[10]。研究还发现LTF可以抑制鼻咽癌细胞的侵袭与转移。过表达LTF的鼻咽癌细胞系的侵袭与转移能力明显下降，接种裸鼠之后成瘤能力亦明显下降，并且肺转移灶明显减少。其分子机制主要是因为LTF能够抑制3'-磷酸肌醇依赖性激酶(3'-phosphoinositide-dependent kinase 1，PDK1)，进而抑制AKT的磷酸化水平，另外LTF可抑制AKT的膜转位。PDK1/AKT通路对肿瘤增殖以及转移均有非常重要的影响。大样本的临床验证亦发现LTF与鼻咽癌转移呈负相关，具有很好的预后判断的价值[15]。综上所述，LTF不仅是鼻咽癌重要的天然免疫分子，还可作为鼻咽癌侵袭、转移和临床进展预测的分子靶标。

3 鼻咽癌相关固有免疫分子在临床转化中的应用前景

目前对鼻咽癌早期的检验方法主要是EB病毒血清学标记物如VCA-IgA、EB病毒早期抗原(early antigen IgG，EA-IgG)的抗体检测，虽然这些指标的单独或联合应用为鼻咽癌的诊断提供了有用的信息，但它们均缺乏足够的灵敏度与特异性，仍然只能作为一种相关指标起提示作用，不能用来作为鼻咽癌的确诊指标。即使是病理性的诊断，也难以一次性取到病变组织，无法避免对微小病灶的多次有创性取样。鼻咽癌非典型病灶型或黏膜下型的病例虽经多次活检，常因无病理切片阳性结果而延误治疗。对于放疗后的病例，当其鼻炎组织表现不典型时，在判断其病变是复发还是放疗反应上，也左右为难;尤其是某些放疗后出现颅脑症状的患者，各项检查(包括病理检查)都很难准确判断到底是放射性脑病还是癌灶向颅内发展，极大影响治疗策略。综上所述，建立一种能对鼻咽癌患者进行筛查、诊断的无创性检测方法，对鼻咽癌的早期筛查、诊断、预防及治疗等具有重要意义。

恶性肿瘤的防治在于早期发现、早期诊断、早期治疗。鼻咽癌相关固有免疫分子作用开始于鼻咽癌的早期阶段，并影响疾病的发生、发展全过程，是一类潜在的临床筛查标记、治疗靶标和预后指标。

PLUNC蛋白家族是正常人体呼吸道黏膜表面天然存在的蛋白质，对人体完全无害，可以研发相关喷鼻剂、外伤敷料等，发挥其抗微生物、抗炎、调节免疫、抗肿瘤的功效。乳转铁蛋白在人乳汁中含量丰富，对婴幼儿的免疫保护作用和营养价值已得到广泛认可，也被广泛应用到乳制品和其他保健品中。本课题组研究发现乳转铁蛋白可直接抵抗EB病毒入侵宿主细胞，并通过抗炎作用抑制微生物感染导致的炎症反应，保护机体免受过度的炎症反应所带来的损伤。提示可以将乳铁蛋白作为预防性药物或营养品应用于EB病毒感染相关的疾病患者如鼻咽癌患者或其易感人群，为乳转铁蛋白在鼻咽癌等EB病毒相关疾病预防和干预中的应用提供新的证据。同时，乳转铁蛋白能抑制鼻咽癌细胞增殖和侵袭转移的功能使得这种人乳中的天然成分在肿瘤的治疗中也显现出重要的临床价值，有望成为临床治疗的分子靶标。相信这些鼻咽癌相关固有免疫分子将具有极大的临床潜在转化应用价值。

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