RNAi与顺铂肿瘤耐药研究进展

黄豪达 综述，赵 健 审校

(广州医学院附属肿瘤医院肺肿瘤科，广东广州 510019）

RNAi与顺铂肿瘤耐药研究进展

黄豪达 综述，赵 健 审校

(广州医学院附属肿瘤医院肺肿瘤科，广东广州 510019）

RNAi;顺铂;耐药;肿瘤

顺铂是一种以二价铂与2个氯原子和2个氨分子结合的重金属络合物，自1978年第1次由FDA批准用于治疗睾丸癌和膀胱癌以来，已经应用于许多实体肿瘤的治疗，但肿瘤对顺铂耐药性的产生严重影响了其疗效［1］。虽然目前已经研发出了第3代的铂类药物，但顺铂仍然是铂类药物中应用最广、最有效的抗肿瘤药物。因此探讨肿瘤对顺铂耐药机制是克服耐药，提高疗效的关键。近年来RNA干扰技术(RNA interference，RNAi）已应用于表观遗传学领域的研究［2］，利用RNAi研究顺铂耐药的分子机制及探讨逆转肿瘤细胞顺铂耐药的方法也随之成为研究的热点，本文作者对RNAi与肿瘤顺铂耐药的最新研究进行综述。

1 RNAi的作用原理

RNAi是同源性双链RNA诱发的序列特异性转录后基因沉默现象，其可以通过与靶mRNA特异性结合，从而使mRNA发生降解而抑制相应蛋白的表达。在起始阶段，双链RNA通过细胞膜进入细胞质中，随后被细胞质中的Dicer酶的Ⅲ型核糖核酸酶切割成21～23个碱基;3’端带有2～3核苷酸末端突出的双链RNA分子，这种小的双链RNA分子被称为小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA）［3－4］。siRNA 同Argonaute 2等一些蛋白酶结合形成大约500 000个bp的复合物，称为RNA介导的沉默复合体(RNA－induced silencing complex，RISC），从功能上分析 RISC应包括解旋酶和1个核酸内切酶Slicer。解旋酶在ATP供能情况下将siRNA的双链解开，正义链从RISC中释放出来，此时，RISC处于激活状态［5］。活化的RISC通过碱基配对与靶mRNA结合，而后mRNA分子断裂，断裂的mRNA分子在核糖核酸酶的作用下被降解。新产生的siRNA片断可再次形成RISC，继续降解mRNA，从而产生高效抑制基因表达的效果。

2 顺铂的抗肿瘤作用及耐药机制

2.1 顺铂的抗肿瘤作用 顺铂本身是一种中性的、正方形Pt(CN）配合物，含有2个氯离子配体位于顺位，这种结构在血浆中及细胞外具有稳定性。当顺铂进入细胞内，由于细胞内高浓度的氯离子，会产生一系列的效应，使顺位的氯离子自发地为水分子所替代，形成具有亲水性的正电子化合物，并易于与许多细胞质基质相结合，特别是内生的亲核物质，如谷胱甘肽、蛋氨酸、金属硫蛋白等形成蛋白质、DNA、RNA等的加合物［6］。水合的顺铂易于与鸟嘌呤碱基上的N7上的N结合，也可与胞嘧啶及腺嘌呤结合，引起DNA链间或链内交联，形成将近 65% 的 1，2—d(GpG），25% 的 1，2—d(ApG），5% ～10%的 1，3—d(GpNpG）的链内交联，还有很少一部分形成链间交联和单功能加合物［7］。随着对顺铂作用机制研究的深入，人们发现:1）只有少于1%的细胞内顺铂会与核DNA结合［8］;2）在无细胞核细胞中，顺铂也产生明显的细胞毒效应［9］。由此推测，顺铂的抗肿瘤效应可能是通过DNA损伤和线粒体的凋亡来共同实现的。

2.2 顺铂的耐药机制 顺铂通过复杂的分子机制发挥其抗肿瘤的作用，主要包括DNA损伤及线粒体的凋亡。但是顺铂耐药最终导致全身化疗的失败，细胞对顺铂的解毒作用可能发生在几个阶段:1）顺铂与DNA结合之前(靶点结合前阶段）;2）出现DNA加合物时(靶点结合中阶段）;3）顺铂与DNA结合后发挥致凋亡作用时(靶点结合后阶段）;4）与顺铂致细胞凋亡作用无直接关联的分子信号通路(非靶点作用阶段）。细胞对顺铂的解毒可能是一个或同时有数个因素在发挥作用，以致肿瘤细胞逃逸顺铂的杀伤作用。

3 RNAi与顺铂肿瘤耐药的研究

3.1 RNAi与靶点结合前阶段的研究 细胞在顺铂与DNA结合前对顺铂的解毒作用，主要是降低细胞内顺铂的药物浓度。铜转运蛋白1(copper transporter 1，CTR1）是一个维持细胞铜代谢平衡的跨膜蛋白，研究［10］发现CTR1在维持细胞内顺铂的浓度也具有重要作用，CTR1是研究酵母菌的时候被发现的，在敲除酵母菌CTR1基因后，酵母菌对顺铂的耐药性增加，并且是由于药物积聚浓度减少所导致的［11］。近来，CTR2也被发现与顺铂的耐药具有密切的关系，Blair等［12］利用慢病毒载体敲除了具有CTR1+和CTR1－的一对鼠亲本胚胎纤维原细胞的CTR2基因，发现在敲除CTR2基因后，顺铂对2种细胞的细胞毒性增加，细胞内顺铂的浓度也增加，证明了CTR2具有与CTR1相反的功能，即CTR2能将细胞内顺铂泵出细胞外，从而减弱顺铂的细胞毒性。ATP7A、ATP7B也属于CTR家族成员，与CTR1共同维持细胞内铜离子的平衡，其也参与了顺铂的耐药［13］。Li等［14］利用 RNAi技术敲除了人肺癌细胞A549的顺铂耐药细胞株的ATP7A基因，能够部分逆转 A549对顺铂的耐药，证明针对ATP7A基因的治疗，可作为逆转顺铂耐药的一个方案。ATP结合盒式蛋白是一类ATP驱动泵，通过将顺铂泵出细胞外而介导顺铂的耐药［15］，其中MRP2可能是该家族中介导顺铂外流从而导致顺铂耐药的主要成员，MRP2的表达水平可能可用于预测肿瘤患者对顺铂的疗效［16－17］。Materna 等［18］则首次利用 RNAi技术设计靶向MRP2的siRNA，敲除人卵巢肿瘤耐顺铂细胞A2780 RCIS的MRP2基因，成功证明MRP2基因敲除后A2780 RCIS细胞重新获得对顺铂的敏感性。

3.2 RNAi与靶点结合中阶段的研究 顺铂的抗肿瘤效应很大程度是通过形成DNA链间或链内交联或形成DNA与蛋白质的交联，抑制DNA复制和转录，导致DNA断裂或误码，从而抑制细胞有丝分裂。而在顺铂耐药肿瘤细胞，由于核苷酸切除修复［19］及跨损伤修复［20］等的参与，使得顺铂对肿瘤细胞DNA及RNA的攻击失效。在核苷酸切除修复系统中，尤为重要的一个基因－人切除修复交叉互补基因1(human excision repair cross－complementing gene 1，ERCC1），已经有许多证据证明，ERCC1与肿瘤患者的预后及对顺铂的治疗效果相关［21－22］，在细胞水平也已经证明在敲除ERCC1的细胞对顺铂的敏感性增加［23］。另一参与核苷酸切除修复的蛋白着色性干皮病基因互补组A(XPA），XPA参与早期DNA损伤的识别，XPA的谷氨酸残基的延伸对接和ERCC1是必须的，XPA－ERCC1复合体能在受损部位的5’端切断DNA单链，从而在核苷酸切除修复中发挥重要的作用，Arora等［24］设计靶向XPA－ERCC1的 siRNA，证明敲除 XPA－ERCC1后能够减少肿瘤细胞DNA的损伤修复并逆转顺铂的耐药。跨损伤修复是指当DNA链在复制过程中遇到损伤而使复制停顿时，机体启动跨损伤修复系统以忽略存在的损伤，继续进行DNA复制，然而付出的代价则是因此而产生的突变。REV3L定位于染色体6q21，是人基因组中与酿酒酵母菌Rev3同源的基因，其能与REV7共同构成参与易误性跨损伤修复的一个主要聚合酶 polζ，Wang等［25］的研究发现，在脑胶质瘤细胞中，顺铂能诱导胶质瘤细胞的REV3LmRNA水平的升高，高表达细胞的REV3L能增强细胞对顺铂的耐药，利用RNAi技术敲除REV3L，则能增加细胞对顺铂的敏感性，表明REV3L可能在顺铂耐药中扮演相当重要的角色。Polζ在执行跨损伤修复的功能时，需要有REV1的参与才能完成，REV1具有cDMP转移酶活性，通过在新生链上无碱基位置插入cDMP来启动polζ的跨损伤修复。Okuda等［26］设计靶向 REV1的shRNA敲除卵巢癌细胞株2008的REV1基因，敲除后的卵巢癌细胞2008－shREV1－3.3比其亲本细胞株对顺铂的敏感性高出1.5倍。与Wang等［25］的研究结果类似，顺铂也诱导卵巢癌细胞株2008的REV1蛋白表达增高，这也说明了跨损伤修复在肿瘤细胞对顺铂产生耐药中发挥着重要的作用。

3.3 RNAi与靶点结合后阶段的研究 细胞自我凋亡信号通路的缺失使肿瘤细胞对顺铂发生耐药。当机体细胞的遗传物质发生不可逆的损伤时，通常在细胞内会有一些类似“检查站”的蛋白来发现这些损伤，并诱导细胞的自我凋亡，从而避免错误的复制。P53就是一个执行这种自我凋亡功能的重要基因。有P53缺陷的细胞不能执行自我凋亡程序，甚至能在不利的条件下继续分裂。但是，在一些野生型P53的肿瘤中，则有其他的因素改变阻断了P53的功能，以促进肿瘤细胞继续生长，例如MDM2基因的扩增或MDM2蛋白的过表达［27］。MDM2在体内最重要的功能是抑制野生型P53的激活转录功能和抗肿瘤活性，其与P53结合使后者泛素化后被蛋白酶体降解并清除［27］。在非小细胞肺癌、结直肠癌组织中都发现 MDM2的扩增［28－29］。Yu 等［30］敲除结肠癌细胞 LoVo的 MDM2 基因后，发现细胞的凋亡增加，而且对顺铂的敏感性也增强，提示MDM2的扩增可能与顺铂的耐药有密切的联系。近来还发现另一个与MDM2关系密切的基因，也与致DNA损伤化疗药物的耐药有关。NEDD8是一种类泛素的修饰蛋白，其能够调控MDM2的表达，从而激活P53的功能［31］，NEDP1则是NEDD8的特异性前体加工酶，能将NEDD8分子从底物上解离出来重新进入类泛素化循环［32］。Watson 等［33］的研究显示，在乳腺癌细胞 MCF－7中，敲除 NEDP1基因后，能增加MCF－7对多西他赛的耐药性，并且在具有野生型P53的HeLa细胞和肾癌786－0细胞中也有相似的结果。细胞凋亡信号通路上某个基因表达的改变，也会导致细胞在靶点结合后阶段对顺铂耐药，Galetin－3就是一个具有调控细胞生长功能的基因，其广泛表达于正常组织和肿瘤组织中，并且与肿瘤的发生、发展、转移等有关［34］。Wang 等［35］利用 RNAi技术证实 Galetin－3参与前列腺癌细胞对顺铂的耐药，在对化疗药物不敏感的 PC3细胞株中敲除 Galetin－3基因后，给予50 μmol·L－1顺铂时 caspase－3、caspase－9 的激活均增加，线粒体溶解增加，细胞质中细胞色素C的含量比对照组细胞高3.8倍，增加了PC3细胞对顺铂的敏感性。此外，对于在细胞凋亡信号通路中发挥重要作用的基因，利用RNAi技术敲除后能增加肿瘤细胞对顺铂的敏感性，例如 Bcl－2 、survivin 、XIAP 基因［36－38］。

3.4 RNAi与非靶点作用阶段的研究 肿瘤细胞对顺铂的耐药，有时也可与顺铂致细胞凋亡信号通路无直接关联，这种耐药的机制既与基因的损伤修复无关，也与顺铂对DNA损伤后监管缺失无关，这里总结为非靶点作用阶段。Beclin1基因也称BECN1基因，是哺乳动物参与自噬的特异性基因，是编码自噬体的主要基因，在维护细胞内环境稳态方面起重要作用，并且是完整细胞器和大分子蛋白降解的主要途径［39］。Beclin1 与多种化疗药物的耐药有关［40－41］，如 5－Fu、依玛替尼，也有报道认为Beclin1是一个新的候选抑癌基因，75%卵巢癌、50%乳腺癌以及40%前列腺癌组织中存在 Beclin1 基因的缺失性突变［42］。Kang等［43］在人口腔鳞癌细胞株Hep－2中，利用RNAi技术探讨Beclin1基因的功能，发现敲除Beclin1基因后可以增加Hep－2细胞对顺铂的敏感性，进一步的研究表明，Beclin1敲除后对顺铂的敏感性增加是通过激活 caspase－3和caspase－9实现的。热休克蛋白27(heat shock protein 27，HSP27）和HSP70被认为是致癌基因并且与肿瘤的化疗耐药有关［44］，在顺铂耐药的卵巢癌细胞中HSP27 高表达［45］。Zhang等［46］在鼠 L929 细胞株中转染人HSP27基因，在Hela细胞中敲除HSP27基因后，发现转染了人HSP27基因的鼠L929细胞对顺铂的敏感性降低，而敲除了HSP27基因的Hela细胞对顺铂的敏感性增加，ASK1/p38的激活增加、Akt激活减少。活性氧是自然界普遍存在的一种具有很高生物活性的氧分子，也是致细胞凋亡中最常见的生物活性因子，活性氧产生所致的氧化还原失衡是细胞凋亡发生的共同中心环节。顺铂能够增加多种肿瘤细胞中活性氧的水平而致细胞凋亡［47］。Mirk基因与减少细胞内活性氧水平而增加胰腺癌细胞的存活有关［48］。Mirk在正常组织中的表达量非常少，而在肿瘤组织中的表达量则明显升高［49］。Hu等［50］发现敲除了 Mirk基因的卵巢癌SKOV3和TOV21G细胞对顺铂的敏感性增加，细胞中PARP和caspase－3表达水平增加，在敲除Mirk基因后的细胞中加入抗氧化剂－N－乙酰半胱氨酸，发现PARP和caspase－3水平有所下降，在给予顺铂治疗、未敲除Mirk基因组，加入N－乙酰半胱氨酸也同样能降低PARP和caspase－3的水平。Mirk并不是一个必须的基因，在敲除Mirk的小鼠没有出现明显的表型［51］，因此Mirk极有可能作为逆转顺铂耐药的一个治疗靶点。

4 展望

顺铂作为许多实体肿瘤一线化疗的基础用药，解决其耐药问题显得尤为重要，近年来利用RNAi技术对顺铂耐药的机制及逆转顺铂耐药的研究在不断深入，应用RNAi沉默某个基因逆转顺铂的耐药已经取得新的进展，但将RNAi技术应用于临床仍面临许多的难题［52］。随着新的RNAi技术的出现和越来越完善的转运载体的设计［53－54］，相信该技术最终可成为肿瘤治疗的一种强有力的手段。

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A

1673－5412(2013）02－0181－05

黄豪达(1985－），男，硕士在读，主要从事肺癌综合治疗方面的研究。E－mail:hhd_wong@163.com

赵健(1963－），男，博士，主任医师，主要从事肺癌综合治疗方面的研究。E－mail:zj_hjh@163.com

2012－10－17）