Downs综合征产前筛查及诊断方法的发展趋势

王琼瑶，童晓文，纪亚忠

(上海市同济医院生殖医学科，上海 200065)

Downs综合征(Downs syndrome，DS)，又称 21三体综合征，是发现最早、最常见的染色体病，在新生儿中的发病率为1/600～1/800［1］，占新生儿染色体病的70%～80%。母亲生育年龄是影响其发病率的重要因素(大于35岁时发病率明显增高)。DS患儿出生时体质量偏低，肌张力低下，头颅小而圆，脸圆而扁平，脸裂细且上外倾斜，眼距过宽，常有斜视，嘴小唇厚，舌大外伸(伸舌样痴呆之名由此而来)，形成特有的面容。约1/2以上的患者有先天性心脏病，主要是室间隔缺损、动脉导管未闭等。男性患者常有隐睾，睾丸有生精过程，但精子常减少，性欲下降，尚未见有生育者。女性患者通常无月经，但少数能妊娠和生育。精神发育迟滞或智能低下是本病最突出最严重的表现。患者平均寿命为16.2岁［2］，其生活往往不能自理，其社会适应和劳动能力较差，给家庭和社会造成了沉重的经济负担。2003年，我国每一新发病例造成39万元的家庭经济负担，给社会造成约45万元负担，而所有新发病例造成的社会负担达81亿元［3］。产前筛查和诊断能在孕早期识别胎儿严重的缺陷，及时干预，从而减少缺陷儿的出生。我国目前对年龄35岁以上的孕妇进行产前筛查，对筛查高危的孕妇常规行进一步的诊断，这对产前检出DS胎儿、防止这类胎儿的出生起到了一定作用。本文就近年来该综合征的产前筛查和产前诊断研究进展综述如下。

1 产前筛查

Downs综合征的产前筛查根据孕期，即在孕早期及孕中期均有不同的标志物。孕早期(11～13周)筛查常用的指标有:胎儿颈后透明层(nuchal translcene，NT)厚度、孕妇血清游离 β-hCG、妊娠相关血浆蛋白A(pregnancy associated plasma protein A，PAPP-A)及孕妇年龄。NT是覆盖胎儿颈部脊柱软组织和皮肤之间的皮下透明层，在早孕期NT的增厚与2l三体的高风险有关。hCG为胎盘分泌的一种糖蛋白激素，在孕10周前随着孕龄的增加而增加，随后随着孕龄逐渐减少，在早、中孕期，孕21三体胎儿孕妇的血hCG高于孕正常胎儿的孕妇。PAPP-A是一种胎盘合成的高分子量的糖蛋白，在早孕期随着妊娠周数增加，母体血清PAPP-A水平也增加。将这三种筛查标志物联合起来共同评估胎儿患Downs综合征的风险，可提高检出率［4］。

孕中期(15～20周)母血筛查是最经典的方法，临床上常用的有二联筛查和三联筛查。二联筛查即以血清甲胎蛋白(AFP)和游离β-hCG为指标，结合孕妇年龄等参数计算胎儿患Downs综合征风险的方法。将AFP、hCG和雌三醇(μE3)三项指标合起来进行所谓三联筛查。研究［5］显示在AFP下降的同时，母血中hCG明显增高，通常可达正常孕妇2倍以上，游离μE3的水平则比正常低25%左右，且各指标间相互独立。

目前，妊娠中期的血清三联检测因其检测通量高、价廉，是使用最广泛的组合。一般情况下DS检出率为 65% ～75%［6］，假阳性率 5%［7］。另外，将AFP值、hCG值以及孕妇的年龄、体质量、怀孕周数利用产前筛查软件可计算出胎儿患Downs综合征的风险。如果结果显示低于1/270，就表示胎儿患病风险较低，不到1%。但如果高于1/270，就表示胎儿患病的危险性较高，应做羊膜腔穿刺进一步检查。

产前筛查对孕妇及胎儿的创伤小，且费用低，普遍应用可以减少Downs综合征儿的出生率，减轻国家及家庭的负担。但是，我国目前产前筛查的工作尚不规范，各实验室间变异系数较大［8］。另外由于不能准确确定孕龄，不在空腹状态下采血，筛查出高风险后确诊率低，活产儿随访时间短或缺乏随访等，使得筛查的结果不理想［5］。

2 产前诊断

产前诊断的适应证有［9］:①年龄＞35岁;②有染色体病或家族中有遗传病;③有先天畸形儿或染色体病儿孕史，或有习惯性流产史;④Downs筛查高危;⑤超声检查胎儿NT＞3 mm;⑥孕期超声检查有胎畸形或宫内发育不良。

2.1 侵入性产前诊断 传统的产前诊断为侵入性方法，通过羊膜腔穿刺、绒毛取样或脐静脉穿刺取材，获得胎儿细胞进行诊断。

2.1.1 羊膜腔穿刺术 是产前诊断最常用的取材方法。由于胎龄大的羊水细胞活力较差，细胞培养难以成功，且胎儿宫内活动较频繁，取羊水时易损伤胎儿，所以通常认为羊膜腔穿刺的最佳时期为16～20周［10］。羊膜腔穿刺术有多种并发症，近来文献［11］报道孕中期羊膜腔穿刺的胎儿丢失率在0.5% ～1.0%之间。有2% ～3%孕妇可出现子宫收缩、腹部肿胀、压痛、阴道出血、感染、漏水或胎儿损伤等并发症［12］。

2.1.2 脐静脉穿刺术 1983年Daffos等［13］报道了在超声引导下经母腹行脐静脉穿刺术，使染色体疾病的产前诊断有了新的途径。但是脐静脉穿刺术技术要求较高，不同的孕周在技术上存在着差异。孕周过小时，脐血管直径太小不易刺入，刺中后也易脱落;孕周过大，则胎儿躯体遮盖脐带，使脐带暴露差，且脐带角质较厚不易刺通，故一般以孕18～26周为宜［14］。该穿刺术的并发症比羊膜腔穿刺多，如出血、流产、早产、胎儿心动过缓、穿刺后畸形羊水过多等。脐带穿刺术的胎儿丢失率为1.2% ～4.9%［15］。

2.1.3 绒毛取样法 有经腹绒毛取样、经阴道绒毛取样两种途径，多在早孕期B型超声引导下进行。因有流产、宫内感染、羊水渗漏、血肿及母体免疫反应等并发症，故术前要对孕妇进行详细全面的病史了解、全身检查、妇科检查及必要的化验检查。

2.2 非侵入性产前诊断 由于传统的产前诊断为侵入性操作取得标本，不仅对胎儿及孕妇造成一定的创伤，并且会带来一些临床并发症，因此寻找和建立一种行之有效的非创性产前诊断方法，降低产前诊断风险、减少成本、缩短诊断时间，是目前产前诊断研究的方向。国内外已有多种无创性产前诊断的研究，多是通过母血中胎儿的遗传物质进行诊断。母血中胎儿的遗传物质主要有:胎儿有核细胞、胎儿游离DNA、胎儿游离RNA，目前用于产前诊断研究较多的是胎儿有核细胞和胎儿游离DNA。

2.2.1 母血中胎儿有核细胞 1969年，Walknowsks等［16］首次报道在母血循环中可能存在胎儿细胞，随后一些学者相继证实了这一发现。进入20世纪90年代以来，随着分子生物学和细胞生物学等技术的发展与完善，形成了从母血循环中识别、分离和检测胎儿细胞等一系列遗传学诊断技术，并应用于产前诊断。孕妇血中胎儿细胞的主要类型包括滋养层细胞、淋巴细胞、粒细胞、单核细胞、有核红细胞(NRBC)等。①滋养层细胞是最早被发现存在于母体外周血循环中的胎儿细胞，存在时间从4～5周至分娩后，数量多且形态特别，但是由于细胞常具有多核及嵌合核型特征，从而影响遗传学结果分析。因此滋养层细胞在非侵入性产前诊断中的应用尚有许多问题需要解决。②胎儿淋巴细胞因在母血循环中出现的时间晚，存在时间长(长达1～5年)，且量极少(仅为胎儿NRBC的0.1%)，难以用于产前诊断。③胎儿有核红细胞是母血中分离量最多也是最容易分离得到的细胞，在妊娠6周时即可出现，妊娠13周时达高峰，后随着孕龄的增加而减少，产后3个月即从母体循环中消失。且NRBC携带胎儿全部基因组信息，可提供遗传学和分子生物学分析。母血循环中的胎儿有核红细胞，可以通过荧光激活细胞分离技术(fluorescence-activated cell sorting，FACS)和磁性细胞分离技术(magnetic cell sorting，MACS)分离纯化［17-18］，然后通过PCR或FISH技术对胎儿单基因病或染色体异常进行诊断。目前已经可以成功地进行13-三体、18-三体、21-三体等非整倍体胎儿的产前诊断。

2.2.2 母血胎儿游离 DNA 1997 年，Lo等［19］在母体外循环中发现了胎儿来源的游离DNA，从而为无创性产前诊断又提供了一个获取胎儿遗传物质的新选择。研究发现，胎儿游离DNA在孕5周时即可在孕妇外周血中检测到，并随孕周数增加而升高。血浆中胎儿DNA的清除半衰期约为16.3 min，分娩后2 h孕妇血浆已经检测不到胎儿DNA。胎儿DNA的提取方法有多种，Chiu等［20］将孕妇外周血经EDTA抗凝之后，以1 600 g离心10 min，取上清液重复离心1次，然后按照血样DNA提取试剂盒说明书中血液或体液DNA的提取方案提取DNA，该方法是目前最为常用的提取方法。

2.3 产前诊断方法 用于产前诊断的方法有多种，较常见的有细胞遗传学方法和分子生物学技术。

2.3.1 细胞遗传学方法 细胞遗传学方法是传统的、临床上最常用的染色体数目异常的诊断方法，也是18-三体、21-三体等染色体疾病诊断的金标准。其主要从染色体的数目形态和结构来研究人类的遗传现象。在产前诊断中，常将取得的绒毛、羊水、脐带血进行细胞培养，将培养后的细胞进行核型鉴定，以发现染色体数目及结构的改变。利用绒毛进行染色体核型分析，由于结果易出现假阳性或假阴性，所以核型异常者需要进行羊水细胞培养以明确诊断。为了正确诊断，羊水细胞培养应至少有15个以上可供分析的核型，显带应达到400条左右。故该方法需要较长时间的细胞培养及大量的人工操作，对染色体核型分析人员技术要求高，失败风险较大。在羊水细胞培养失败、DNA分析无法诊断或错过绒毛和羊水取样时机等情况下，可利用脐带血进行细胞遗传学分析。

2.3.2 分子生物学技术 分子生物学技术是近几年发展起来的诊断方法。常用于染色体疾病产前诊断的技术有:荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)、实时荧光定量 PCR(realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR)、引物延伸预扩增法(primer extension prea-mplification，PEP)、套式PCR。

2.3.2.1 FISH FISH 是在 20 世纪 80 年代末在的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。FISH的基本原理是将DNA或RNA探针用特殊的核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用荧光素分子偶联的单克隆抗体与分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析。常用的探针有以下三类:①染色体重复序列探针，主要是指着丝粒α-卫星 DNA重复序列探针和端粒重复序列探针，用以检测染色体数目异常，同时由于G显带时，端粒区是苍白的，因此涉及此区的易位常难以检测，而应用端粒探针则弥补了G显带的不足;②染色体涂染探针，包括通过流式分选或显微切割获得的全染色体或染色体臂以及特异性区带的涂染探针，用以检测染色体数目或结构异常;③染色体单一序列探针，包括各类人工染色体探针，如酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)、细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)、P1 人工染色体(P1 artificial chromosome，PAC)探针，主要用以识别染色体的易位、缺失和扩增。目前国产的已用于临床的染色体诊断的FISH 探针有:21、18、13/21、13/18 号和 X、Y 等探针［21-22］。FISH比传统的核型分析操作简便迅速、直观性强，可用于外周血细胞、脐血、未经培养的分裂期和间期细胞。间期细胞容易获得，且其数量多使分析的细胞数目也相应的增多，这是FISH技术最大的优势。但FISH探针试剂价格昂贵，极大限制了它在临床上的应用。

2.3.2.2 RTFQ PCR 虽然孕妇血中胎儿游离DNA较胎儿完整细胞含量丰富，但其绝对量仍然微乎其微，PCR技术的发展使得极少量的胎儿DNA不再成为限制产前基因诊断的因素。荧光定量PCR在1993年首次被应用于Downs综合征的产前诊断［23］。其原理是在PCR反应体系中加入荧光标记探针，通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化来获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性。应用于染色体异常的产前诊断时，常选用目标染色体上的几个微卫星重复序列STR作为标记，利用PCR扩增，将其产物荧光染色后，根据荧光强度的变化，确定是否存在染色体数目的异常。该方法在每次实验中均有管家基因为内参照基因，通过稳定的内参照基因校正，可以较准确地反映目的及数量。实时荧光定量PCR的整个反应过程以及结果的测定都在密闭仪器中自动完成，避免了由于污染造成的假阳性。与常规PCR相比，实时荧光定量PCR具有特异性更强、数据稳定、有效解决PCR污染和自动化程度高等优点。该方法对普通染色体非整倍体检测的灵敏度非常高，平均为99.2%，并且在很多研究中心敏感度达到了100%［24-25］。现已在国外多个产前诊断中心被广泛应用［25-27］，将QF-PCR的阳性结果作为终止妊娠的指征［28］。

2.3.2.3 基因组测序 基因组测序技术可应用于母血中胎儿有核红细胞的检测，也可应用于分析母血中胎儿游离DNA。用于Downs综合征产前诊断的技术主要是大规模并行基因组测序技术，其基本原理是对孕妇血浆中的所有DNA片段进行高通量测序，然后对测序结果进行生物信息分析，由于孕21三体胎儿的孕妇外周血中21号染色体的游离DNA比例高于孕正常胎儿的孕妇，因此可计算出胎儿患Downs综合征的风险。2008年，Chiu等［29］利用此技术检测了28例孕妇外周血标本，其中14例Downs综合征胎儿和14例正常胎儿均被准确检测。2010年，Lo等［30］的研究也证明了该技术应用于利用母血胎儿游离DNA进行非侵入性产前诊断是可行的。2011年，Chiu等［31］的研究中，该项技术应用于产前诊断，Downs综合征胎儿的检出率达100%。该技术有所需样本量少、检出率高等优点，但因容易出现假阴性结果、检测准确率不高而在临床上广泛应用有一定的局限性。

2.3.2.4 套式PCR 原理是针对某一个待检基因，设计两对特异性引物，其中一对引物巢居于另一对引物扩增产物的内部。首先利用外侧引物进行PCR扩增，获得一定量的产物后，再用第二对引物进行扩增，PCR反应的敏感性和特异性都得到明显提高。其缺点就是第二对引物扩增时引起交叉污染的概率较大。

2.3.2.5 PEP-PCR 引物延伸预扩增法(primer extension prea-mplification，PEP)是一种通过随机引物将细胞克隆或单个细胞进行全基因组扩增，有效地使模板DNA的含量达到足以被检测水平的方法。在此基础上再进行特异序列的扩增，即聚合酶链反应即可完成对微量靶基因的分析。它对于用孕妇外周血中极少量的胎儿遗传物质进行产前基因诊断十分重要，使一个样本完成多个位点的基因分析成为可能。目前已有研究，将母血中单个NRBC应用PEP-PCR扩增技术进行产前诊断的报道［32］。

2.3.3 两种方法的比较 分子生物学技术与传统的G显带核型分析相比具有以下优点:快速。核型分析方法因需要对胎儿细胞进行培养然后进行，通常从获得标本到出报告需要2～3周的时间，而利用QF-PCR或者FISH技术不需要进行细胞培养，可以直接提取胎儿DNA进行试验，整个过程只需数小时，孕妇及家人可以在采集标本后的24～48 h内收到诊断报告，大大缩短孕妇等待时间及减轻其在等待期间的焦虑。阳性结果的孕妇，可以及早终止妊娠，争取最佳医疗处理时间。所需样本量少。完成核型分析至少需要15～20 ml的羊水标本或2～4 mg的绒毛标本，而QF-PCR和FISH只需要2 ml外周血就可以完成实验［33］。成本低。与核型分析相比较，分子生物学技术的检测成本大大减低，可以大大减轻孕妇及家人的经济负担。操作简便。核型分析操作复杂，对操作人员技术要求高，而应用分子生物学技术操作简便，并且可以自动化操作，适合在我国现有国情下进行大规模应用。但是分子生物学技术仍有一些不足之处，如荧光定量PCR技术目前只能够检测21、18、13、X及Y5种染色体非整倍体，无法对所有染色体进行检测。且存在一定的局限性，若单独应用将会有染色体结构异常及嵌合体不能检出。

3 展望

利用母血中胎儿的遗传物质进行Downs综合征的产前诊断，因取材无创、检测时间短有着明显的优势。无创性产前诊断的基础研究已取得很大进展，临床应用研究也取得了初步成功，但由于其尚处于起步阶段，在临床应用中仍存在有许多问题，如何有效地提取胎儿DNA，避免母血细胞的污染，以及减少费用等等。随着技术的不断进步和发展，这些问题逐步被解决，无创性的产前检查技术可望成为产前诊断的常规。

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