北极海泥来源抗菌活性真菌的筛选及菌株H5的初步研究

倪孟祥，胡 颖

（中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京210009）

从海洋微生物寻找新药已成为开发药物资源的重要策略之一［1，2］。国内外对海洋细菌和放线菌的活性天然产物的研究起步较早，发现的新化合物数量也较多，相比之下对海洋真菌的系统研究起步较迟，直到20世纪90年代才进入较快速的发展阶段［3］。目前，人们已经从海洋真菌的发酵产物中发现了1000多种新的次生代谢产物，这些代谢产物呈现出良好的抗肿瘤、抗菌、抗病毒等生物活性，成为当前海洋药物研究的热点［4，5］。

作者从北极海泥中分离真菌，采用其发酵液进行抗菌活性筛选，并鉴定其种类、研究其活性代谢产物的性质，以期发现具有显著抗菌活性的菌株，为建设海洋真菌种质资源库、开发新的微生物药物奠定基础。

1 实验

1．1 材料

1．1．1 样品来源

北极海泥来自北极黄河站附近海域潮间带。

1．1．2 指示菌

金黄色葡萄球菌 （Staphyloccus aureus）ATCC 25925、大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC25922、多株金黄色葡萄球菌临床分离耐药菌、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、白色念珠菌（Candida albicans），均由中国药科大学微生物学实验室提供。

1．1．3 主要试剂

DNA Marker、Taq MasterMix，康为；引物由上海生工合成；其它试剂均为国产分析纯。

1．2 培养基

1．2．1 分离培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯去皮，200g切成小块，加水煮沸30min，4～6层纱布过滤，加20g葡萄糖、20g海盐、15～20g琼脂，蒸馏水1000mL。

察氏培养基：NaNO32g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O 0．5g，KCl 0．5g，FeSO4·7H2O 0．01g，蔗糖30g，海盐20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL。

沙氏培养基：蛋白胨10g，葡萄糖4g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL。

改良的马丁培养基：葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母粉2g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O 0．5g，海盐20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL。

葡萄糖酵母膏蛋白胨琼脂培养基：葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母膏0．5g，海盐20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL。

1．2．2 指示菌培养基

营养琼脂培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL。

1．2．3 发酵培养基

种子发酵培养基：马铃薯葡萄糖液体培养基。发酵培养基：察氏液体培养基。

1．3 方法

1．3．1 菌株的分离

采用平板稀释法分离菌株。取海泥样品1g，用无菌海水逐级稀释至10－1、10－2、10－3、10－4、10－5数量级，各取0．2mL均匀涂布于分离平板上，每个稀释度涂3个平板，28℃倒置培养，每天观察是否有新菌落出现，挑取形态相异的菌落划线纯化，纯化的菌株斜面置于4℃冰箱保存。

1．3．2 菌株发酵液的制备

从活化斜面中取菌丝块或孢子接种于装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，28℃、200r·min－1下培养3d作为种子。将种子以8%的接种量接入装有100mL发酵培养基的500mL摇瓶中，28℃、200r·min－1下培养7d。将发酵液用低温高速离心机8000r·min－1离心20min，取上清布氏漏斗抽滤，得到澄清发酵液，用无菌的0．22μm滤膜过滤，得无菌体的澄清发酵液，4℃冰箱保存。

1．3．3 菌株发酵液体外抗菌实验［6］

采用滤纸片法进行抗菌实验。用无菌水将斜面培养的指示菌洗下，与适量培养基混匀倒平板，将含有待测样品的无菌滤纸片贴于平板上，细菌培养24h，真菌培养48h，观察是否有清晰透明的抑菌圈产生，并测量抑菌圈的直径大小。

1．3．4 菌株 H5的鉴定

1．3．4．1 培养特征观察

采用标准条件培养菌株，观察并记录PDA平皿菌落特征，包括菌落的正背面颜色、菌落直径、菌落质地、有无分泌物等。

1．3．4．2 显微形态观察

挑取菌株产孢器及菌丝制成水封片，吕氏碱性美蓝染色，进行镜下观察，记录菌丝特征及分枝情况、孢子和产孢器结构等。

1．3．4．3 ITS序列分析

采用改良的CTAB法提取基因组DNA［7］。

ITS序列的PCR扩增采用通用引物：ITS1（5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′）和 ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）。PCR 扩 增 条 件：95℃ 预 变 性4min，95 ℃ 30s，55 ℃ 40s，72 ℃1min，循环30次，72℃延伸8min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶检测，纯化后交南京思普金公司测序。

将测序得到的ITS序列通过Blast与GenBank中的核酸序列进行比对，利用 BioEdit 7．0．9．0及Mega 5．0软件进行系统发育分析。采用邻接法（Neighborjoining method）构建系统发育树，并对所构建的系统发育树进行自举分析（Bootstrap），Bootstrap检验值≥50%（1000次重复），估算其内分支的支持率。

1．3．5 菌株H5发酵液中抗菌活性物质的理化性质初步研究

1．3．5．1 活性物质对温度、pH 值的稳定性实验［8］

将发酵液12等分，分别调 pH 值至1．0、2．0、3．0、4．0、5．0、6．0、7．0、8．0、9．0、10．0、11．0、12．0，再将各份5等分，分别置于4℃、40℃、60℃、80℃及100℃水浴1h，各样品以不同pH值水溶液和原发酵液为对照进行体外抗菌实验，观察抑菌效果。

1．3．5．2 活性物质的萃取实验［9］

将发酵液12等分，分别调pH 值至1．0、2．0、3．0、4．0、5．0、6．0、7．0、8．0、9．0、10．0、11．0、12．0，再将各份6等分，分别加入等体积的乙酸乙酯、氯仿、甲苯、乙酸丁酯、石油醚及正丁醇，4℃静置，待完全分层后分别取有机相和水相，水相将pH值调回中性后同有机相均以原发酵液为对照进行抑菌实验，观察抑菌效果。

1．3．6 菌株H5发酵液活性物质的提取

将发酵液调pH值2．0，过滤，除去不溶性杂质，然后过已预处理的大孔离子交换树脂D380，去除大部分色素及杂质，收集洗涤液，接着用大孔吸附树脂HPD300吸附，再用50%乙醇洗脱，分部收集洗涤液、洗脱液，测定不同洗涤液、洗脱液的活性，将有活性的部分合并，减压浓缩成膏状物，即得活性物质的脱盐粗提物。

1．3．7 粗提物的薄层层析（TLC）

将粗提物溶于少量甲醇中，在硅胶G板（20cm×15cm）上点样，筛选后选用正己烷－正丁醇（4∶1）为展开剂，展层后干燥，在245nm的紫外灯下观察，并用10%硫酸乙醇溶液喷雾显色。

2 结果与讨论

2．1 菌株的分离及活性筛选

本实验选用添加链霉素的5种不同的培养基从北极海泥样品中共分离得到17株真菌。对这17株真菌的发酵产物进行抗菌活性初步筛选，结果发现菌株H5、H6对一种或几种指示菌有抗菌活性。其抑制6种指示菌的能力比较见表1。

从表1可以看出，菌株H5的抗菌活性较强且抗菌谱较广，且对多株金黄色葡萄球菌临床分离耐药菌烟曲霉属的菌株相似度较高，系统发育树见图3。有较好的抑制作用，因此选取H5进行后续研究。

表1 活性菌株的抗菌作用Tab．1Antimicrobial activity of the active marine fungus

图3 基于ITS序列构建的N－J树Fig．3 The neighbor－joining tree based on ITS rDNA sequences

2．2 菌株H5的鉴定结果

2．2．1 形态学鉴定

菌株H5在PDA平板上生长速度较快，培养7d后，菌丝蔓延至整个平板；菌落中心灰蓝色，外缘白色，反面鲜黄色；菌落呈圆形，正面扁平且中心略微突起，边缘呈树枝状，产鲜黄色色素；质地疏松，绒毛状，无明显纹饰（图1）。生物电镜下观察菌丝具横隔，无分枝；分生孢子梗顶端膨大成为顶囊，呈半球形，顶端着生成串的球形分生孢子（图2）。根据其形态特征初步鉴定为烟曲霉属（Aspergillus fumigatus）。

2．2．2 ITS序列分析

PCR扩增得到的菌株H5的ITS序列全长为557bp。将该序列与GenBank数据库中的真菌ITS序列进行Blast分析，结果表明，菌株H5的ITS序列与

由图3可知，菌株H5与烟曲霉属Aspergillus fumigatus isolate 13－F2处于同一分支，亲缘关系最近，同源性达到99%，因此可以确定菌株H5属于烟曲霉属。

2．3 菌株H5发酵液中抗菌活性物质的理化性质

2．3．1 pH值及温度对发酵液抗菌活性的影响（图4）

图4 pH值及温度对菌株H5发酵液抗菌活性的影响Fig．4 Effects of pH value and temperature on the antibacterial activity of strain H5′s broth

由图4可知，菌株H5发酵液在酸性至中性条件下抗菌活性较高且性质较稳定（不同pH值水溶液、对照均无抑菌圈形成，排除因pH值不同对实验结果造成干扰的可能）。pH值1～5的发酵液沸水浴l h后抗菌活性几乎不变。但在碱性条件下其抗菌活性明显减弱，pH＞8时丧失抗菌活性，表明抗菌物质可能在碱性条件下被破坏。

2．3．2 活性物质萃取实验结果

通过观察萃取后各样品形成的抑菌圈的大小，发现菌株H5的发酵液只有在酸性至中性条件下才能被有机溶剂萃取，在乙酸乙酯、氯仿、甲苯、乙酸丁酯、石油醚、正丁醇萃取液中有不同浓度活性物质存在（见图5），正丁醇的萃取效果相对最好，说明活性物质极性较大。

2．4 发酵液中活性成分的初步分离提纯结果

图5 不同pH值条件下抗菌活性物质在不同有机溶剂中的溶解量Fig．5 Partition of the antibiotics of strain H5in the organic solvents under different pH values

发酵液的粗提物经硅胶G薄层层析后，通过10%硫酸乙醇溶液喷雾显色可观察到4个斑点。经活性检测后发现其中1个斑点（Rf＝0．4）具有较强的抗菌活性，且与其它斑点之间的分离度良好（表2），为后续分离纯化工艺奠定了基础。

表2 活性物质粗提物的薄层层析Tab．2 TLC of the crude extract with antimicrobial activity

3 结论

从北极海泥中分离筛选抗菌活性海洋真菌，共分离得到真菌17株，其中菌株H5、H6的发酵液具有较好的抗菌活性，菌株H5的活性更强。根据菌株的形态学特征和ITS序列分析结果，鉴定菌株H5属烟曲霉属（Aspergillus fumigatus）。菌株H5的发酵液对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌均有良好的抑制活性，尤其是对耐甲氧西林及苯唑西林的金黄色葡萄球菌有很强的抑制作用，具有很好的研究应用前景。此外，该菌株抗菌代谢产物为极性较大、热稳定性较好、耐酸不耐碱的物质。采用弱极性大孔树脂分离活性物质，薄层检测发现，有1个活性组分有较强的抗菌活性。后期拟进一步分离纯化菌株H5代谢产生的抗菌活性物质，对其展开深入的研究，以期发现结构新颖的天然抗菌化合物。

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