动物内源性多肽CGA-N46生物信息学分析

李瑞芳，卢研博，陈士华，张慧茹，王 彬，熊前程

（河南工业大学生物工程学院，河南郑州450001）

抗菌肽（antimicrobial peptides）又称抗微生物肽或肽抗生素，是动物界和植物界的先天免疫系统的主要效应分子，原指昆虫体内经过诱导产生的分子量在4ku左右、具有抑菌性质的碱性多肽物质。从目前的研究来看，抗菌肽广泛存在于多种生物体内，具有广谱抗菌、抗肿瘤、抗病毒活性，构成机体的“第二防御体系”。因此，抗菌肽是存在于动植物、昆虫、微生物等生物体内，具有抗菌活性的肽类物质。研究发现，抗菌肽水溶性好、分子质量小、呈强碱性、热稳定性高、无免疫原性，有着与传统抗生素完全不一样的产生途径和作用机制，病原菌不易对其产生耐药性［1］。一般情况下，抗菌肽只作用于原核细胞和发生病变的真核细胞，而对常态的真核细胞几乎没有作用［2］。因此，抗菌肽有望被研发成替代抗生素的药物，亦有可能成为无毒或低毒的抗肿瘤新药［3］。肽类抗生素为新型药物的设计提供了一个很有代表性的范例［4］。

嗜铬粒蛋白（chromogranin A，CGA）是存在于动物神经和内分泌细胞的由439个氨基酸组成的可溶性蛋白［5］。CGA N端衍生多肽对真菌和细菌表现出不同的抑制作用，其中CGA N端31位～76位氨基酸肽段（CGA-N46）具有较强抗真菌的功能［6］。为揭示CGA-N46的抗真菌作用、副作用及选择性毒力的基本原理，本实验室正在对CGA-N46抗真菌作用机制进行研究。利用生物信息学软件，对CGA-N46的理化性质、结构特征等进行分析，通过与已有抗菌肽进行比对，推测CGA-N46的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 CGA-N46氨基酸序列 NH2-PMPVSQE CFETLRGHERILSILRHQNLLKE LQ-DL ALQGAKERAHQQ-COOH。

1.1.2 软件和工具 ProtParam、TMpred和WoLF PSORT 工具，GOR4、SIMPA96、Signal3.0 Server、NetPhos 2.0Server和NetOGlyc 3.1Server软件，SWISS-Model程序。

1.2 方法

1.2.1 CGA-N46理化性质分析 利用http：／／www.expasy.ch／tools／网站ExPASy分析系统中的ProtParam工具分析CGA-N46氨基酸序列，对其氨基酸组成、电荷分布、电荷聚集区域、等电点、稳定性、亲水性和半衰期等理化参数进行分析。

1.2.2 CGA-N46二级结构预测 利用http：／／pbil.ibcp.fr／网站的secondary structure prediction软件中的GOR4、SIMPA96方法综合观测CGAN46的二级结构。

1.2.3 CGA-N46跨膜区和信号肽分析 参照文献［7］，利用 http：／／www.ch.embnet.org／software／TMPRED＿form.html网站SWISS-PROT的跨膜蛋白数据库Tmbase的分析工具TMpred和http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／网站Signal3.0 Server软件分析CGA-N46氨基酸序列，预测其跨膜区段和取向。

1.2.4 CGA-N46进入细胞后的细胞内定位 参照文献［8］，利用网站http：／／psort.hgc.jp／form2.html的WoLF PSORT工具基于其氨基酸序列预测蛋白质亚细胞定位点。

1.2.5 CGA-N46糖基化和磷酸化位点分析 利用http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetOGlyc／网站的NetOGlyc 3.1Server软件和http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetPhos／网 站 的 NetPhos 2.0 Server软件分析CGA-N46的糖基化和磷酸化位点。

1.2.6 CGA-N46三维空间结构分析 利用http：／／swissmodel.expasy.org／repositoru／网 站 的SWISS-Model程序预测CGA-N46的三级结构。

2 结果

2.1 CGA-N46的理化性质

CGA-N46共有46个氨基酸，其氨基酸组成见表1。由软件分析可知，CGA-N46内部没有二硫键，带负电荷氨基酸（Asp＋Glu）总数为6个，带正电荷氨基酸（Arg＋Lys）总数为6个，总体电荷分布情况为：000000-00-00＋00-＋00000＋00000＋-00-000000＋-＋0000。该蛋白质等电点为7.38，分子质量为5 363.1u（5.363ku）。

表1 CGA-N46氨基酸组成Table 1 Amino acid composition of CGA-N46

分析CGA-N46的稳定性，发现该蛋白质不稳定指数为75.91，为不稳定蛋白。蛋白质疏水性的预测在蛋白质组学研究中不可缺少，一般根据该蛋白质的GRAVY值来预测。GRAVY值的范围在2与-2之间，负数表示该蛋白质为亲水蛋白，正数表示该蛋白质为疏水蛋白。CGA-N46总平均亲水性为-0.674，因而为亲水蛋白。软件分析得知，CGAN46在哺乳动物、酵母中的半衰期都大于20h。

2.2 CGA-N46的二级结构预测

利用 GOR4、SIMPA96方法综合观测CGAN46的二级结构，分析可知，在CGA-N46的二级结构中，α螺旋占总体二级结构的80.43%，无规则卷曲占总体二级结构的19.57%，因此，CGA-N46总体呈现α螺旋形式。其二级结构预测如图1所示。

图1 CGA-N46二级结构预测Fig.1 Secondary structure prediction of CGA-N46

2.3 CGA-N46的跨膜区和信号肽预测

利用SWISS-PROT的跨膜蛋白数据库Tmbase的分析工具TM pred分析CGA-N46氨基酸序列，预测CGA-N46的跨膜结构。预测结果表明，CGAN46没有跨膜的可能性，即没有跨膜区。利用SignalP-NN软件预测CGA-N46的信号肽序列，分析显示该蛋白质没有信号肽。跨膜区和信号肽预测结果表明，CGA-N46是位于细胞质中的胞浆蛋白。

2.4 CGA-N46在细胞内的定位

预测结果再现了该蛋白的信号肽序列、核定位信号、跨膜区定位、信号序列识别、线粒体定位信号、膜拓扑结构等信息，结果表明CGA-N46进入细胞之后主要分布于细胞核（52.2%），其他的依次为细胞 质 （26.1%）、细 胞 骨 架 （17.4%）和 线 粒 体（4.3%）。

2.5 CGA-N46糖基化位点和磷酸化位点预测

蛋白质糖基化（O-Glycosylated）对蛋白质功能具有重要影响，如许多重要的细胞表面蛋白、识别蛋白和分泌蛋白都带有一个或数个糖基。利用NetO-Glyc 3.1Server软件分析CGA-N46糖基化位点。预测结果表明，CGA-N46没有糖基化位点。

磷酸化（phosphorylation）是蛋白质翻译后广泛存在的一种化学修饰，是调节酶或蛋白质活性的重要步骤。利用 http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetPhos／网站的 NetPhos 2.0Server软件分析CGA-N46磷酸化位点，结果如表2所示。预测结果表明，CGA-N46有2个磷酸化位点，分别位于第5位丝氨酸和第11位的苏氨酸。

表2 CGA-N46磷酸化位点预测Table 2 Phosphorylation site prediction of CGA-N46

2.6 CGA-N46三维空间结构

利用SWISS-Model程序预测CGA-N46的三级结构，结果在PDB数据库中没有找到有效的模板，表明对该类蛋白质空间结构的研究不多。

3 讨论

研究发现，动物抗菌肽多为带阳离子电荷两亲α-螺旋构型的多肽，其电荷特性便于其与负电荷的细胞膜表面相互作用，通过毯式模型或孔洞模型杀死真菌［9］。通过生物信息学分析发现，CGA-N46虽然属于α螺旋构型的多肽，但与常见抗菌肽不同，CGA-N46呈电中性，等电点7.38，不能采用等电点为4.62的cathelicidins家族蛋白的作用机制［10］，从带负电的脂多糖位置处转移阴离子，使细胞壁发生紊乱，或与细胞壁表面带负电荷的磷壁酸通过静电引力结合，使抗菌肽穿过细胞壁靠近细胞质膜，对细胞质膜起作用。也不能通过静电引力结合在带负电荷的磷脂双分子膜上，形成栅栏模型、毯式模型或胶束状结构，破坏细胞膜或细胞器生物膜达到抗菌的目的［11］。CGA-N46甘氨酸、脯氨酸含量低，也不会像脯氨酸含量高达33%的抗菌肽apidaecin与一种或几种和蛋白合成相关的成分结合并发挥作用，起到杀菌效果［12］。

CGA-N46为亲水性、α螺旋，含有一个半胱氨酸，可能会通过形成分子间二硫键，如抗菌肽β-defensin-3［13］，通过抑制细菌或真菌细胞壁的形成，使细菌或真菌不能维持正常的细胞形态而使其生长受阻，并导致细胞壁穿孔，最终杀死细菌或真菌。CGA-N46没有跨膜区，为胞浆蛋白。因此，CGAN46可能在细胞内存在靶位点，作用于细胞内某些生物分子，通过影响其结构与功能而起到杀菌作用。

近几十年来，真菌感染现象已是非常普遍，免疫缺陷病人更甚，其感染真菌的病死率逐年上升。而当前，耐药性是真菌感染性疾病治疗面临的一个重要问题，即多数患者对常规的抗生素产生了耐药性［14］。因此，寻找效性好、风险性低的新型抗生素刻不容缓。抗菌肽采用不同的机制杀死真菌而不引起菌体产生耐药性，被认为是传统抗生素的最优替代品［15］。CGA-N46是一种新型抗菌肽，其抗真菌作用机制也许不止上述预测的几个方面。因此，阐明CGA-N46的作用机制还需要通过同位素标记、基因缺失等实验手段，并结合先进的生物物理仪器进行分析研究。同时，CGA-N46的其他生物学活性还有待进一步深入研究。

［1］ 魏照征，田 健，伍宁丰，等.抗菌肽构效关系及其表达策略研究进展［J］.生物技术通报，2011（2）：7-11.

［2］ 祝 骥，高 飞，易 喻，等.抗菌肽的研究进展［J］.生命科学，2008，20（4）：605-607.

［3］ 孟 硕，王凤山.抗肿瘤活性抗菌肽的研究进展［J］.中国生化药物杂志，2011，32（3）：241-244.

［4］ Fedders H，Podschun R，Leippe M.The antimicrobial peptide Ci-MAM-A24is highly active against multidrug-resistant and anaerobic bacteria pathogenic for humans［J］.Int J Antimicrob Ag，2010，36（8）：264-266.

［5］ 李瑞芳，熊前程.嗜铬颗粒蛋白A研究进展［J］.生命科学研究，2010，14（4）：350-354.

［6］ 李瑞芳，张添元，罗进贤，等.嗜铬粒蛋白N区抗真菌活性片段研究［J］.中山大学学报，2006，45（2）：64-67.

［7］ 陈士华，吴兴泉，曹 健.罗伊氏乳杆菌亚油酸异构酶的生物信息学分析［J］.河南工业大学学报：自然科学版，2011，32（2）：45-48.

［8］ 冯媛媛，侯 佩，李颖楠，等.番茄ARF2蛋白的生物信息学分析与亚细胞定位［J］.生物化学与生物物理进展，2012，39（1）：51-58.

［9］ Wang Y，Jiang Y，Gong T，et al.High-level expression and novel antifungal activity of mouse Beta defensin-1mature peptide inEscherichiacoli［J］.Appl Biochem Biotech，2010，160（1）：213-221.

［10］ Kosciuczuk E M，Lisowski P，Jarczak J，et al.Cathelicidins：family of antimicrobial peptides［J］.Mol Biol Rep，2012，39：10957-10970.

［11］ Amiche M，Galanth C.Dermaseptins as models for the elucidation of membrane-acting helical amphipathic antimicrobial peptides［J］.Curr Pharm Biotechnol，2011，12：1184-1193.

［12］ Bolintineanu D，Hazrati E，Davis H T，et al.Antimicrobial mechanism of pore-forming protegrin peptides：100pores to killE.coli［J］.Peptides，2010，31（1）：1-8.

［13］ Harder J，Bartels J，Christophers E，et al.Isolation and characterization of humanβ-defensin-3，a novel human inducible peptide antibiotic［J］.J Biol Chem，2001，276（8）：5707-5713.

［14］ Asoodeh A，Azam A G，Chamani J K.Identification and characterization of novel antibacterial peptides from skin se-cretions of euphlyctis cyanophlyctis［J］.Int J Pept Res T-her，2012，18：107-115.

［15］ Chapuis H，Slaninova J，Bednarova L，et al.Effect of hydrocarbon stapling on the properties of a-helical antimicrobial peptides isolated from the venom of hymenoptera［J］.Amino Acids，2012，43：2047-2058.