蠔猪刺和乌樟水提物对禽源大肠埃希菌和沙门菌抑菌作用研究

牟 亚，张 郁，西格基，聂艳如，陈朝喜＊

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041；2.黑水县畜牧兽医局，四川阿坝623500）

抗生素在促进动物生长和提高养殖经济效益等方面发挥了重要作用，然而由于其广泛应用尤其是不合理使用和滥用导致细菌产生耐药性并带来了很多新的问题［1］。世界卫生组织（WHO）提出2012年将重点控制抗生素耐药性问题，因为跨越动物、人和生态系统的疾病很多，60%对人构成危险的病原体来源于动物，并且可能引起人和动物发生严重的公共卫生事件，因此迫切需要加强和改善公共健康与动物健康系统之间的关系［2］。相关研究表明，由于中药的特殊性，细菌对中药尤其是中药复合制剂不易产生耐药性［3］。

乌樟（Berberis julianae Schneid）又称香樟，在我国主要分布于长江以南及西南地区，尤其以四川省宜宾地区生长面积最广。除了具有净化有毒空气能力和用作建筑材料外，其含有的松油二环烃、樟脑烯、柠檬烃、丁香油酚等化学物质具有抗癌、防虫和治疗腹痛和皮肤瘙痒等功效［4-5］。

蠔猪刺（Cinnamomum camphora （L.）Presl）属小檗碱科，主要分布我国湖北、四川、贵州、湖南、广西等省份，其中四川凉山州地区有十几种，在四川凉山和贵州省民间常用烧伤、腹泻等湿热疾病的治疗验方［6-7］。

本文旨在初步探讨蠔猪刺和乌樟及其与常用抗菌药物的联合应用对禽源沙门菌及大肠埃希菌的体外抗菌作用，以期探究其对两种常见的禽类病原菌的抑制或杀灭效果，并分析其延缓细菌抗生素产生耐药性的原因。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 蠔猪刺采自四川省巴中市南江县的丛林中；乌樟采自湖北省利川市市区的绿化带；抗菌药物（大观霉素、环丙沙星、红霉素、林可霉素和替米考星）购自中国兽医药品监察所，所有抗菌药物临用前配成5 120μg／mL的母液备用。

1.1.2 菌株 大肠埃希菌标准菌株ATCC25922由西南民族大学兽医药理学教研室保存。试验中所用的沙门菌和大肠埃希菌采自四川省成都市洛带古镇某养殖场的跑山鸡粪便，经实验室分离纯化得到纯化菌株。

1.2 方法

1.2.1 蠔猪刺和乌樟水提物的制备 分别将采集的蠔猪刺和乌樟样品适当清洗，除去表面的污渍和泥沙，剪成约2cm长短的小段后37℃烘干后备用。取乌樟干品1kg，蒸馏水浸泡2h后煮沸，文火煎煮30min，反复3次，最后滤出煎液，合并3次煎煮液后浓缩定容至1 000mL，使水提物相当于干物质含量为1g／mL，121℃高温灭菌20min后置于4℃冰箱保存备用。在蠔猪刺水提物的制备过程中其煎煮步骤同乌樟，取蠔猪刺4.0kg，最后定容至1 000 mL，使水提物相当于干物质含量为4g／mL，121℃高压灭菌20min后置于4℃冰箱保存备用。

1.2.2 菌悬液的制备 将标准菌株ATCC25922和纯化后的禽源大肠埃希菌和沙门菌的菌种经LB肉汤增殖24h后，制成含菌数约为105cfu／mL～106cfu／mL的菌悬液。

1.2.3 MIC和FIC测定 参照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的微量肉汤稀释法对蠔猪刺和乌樟水提物及大观霉素等抗菌药物进行最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）和部分抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration，FIC）的测定。

1.2.3.1 最小抑菌浓度测定 具体操作步骤如下：96孔细胞培养板前11列各孔加100μL MH肉汤，然后分别在第1、2列的第1孔加入100μL药物A，依次倍比稀释至第11列，第1、2列的前11孔各加入100μL制备好的菌悬液。同样，在第3、4列加入100μL药物B，依次倍比稀释至第11列，最后第3、4列的前11孔各加入100μL制备好的菌悬液。37℃培养16h～24h后，计算MIC。临床共分离到的11株大肠埃希菌和16株沙门菌，每个菌株对每个药物做两个重复。

1.2.3.2 联合药敏试验 棋盘稀释法进行联合药敏试验的步骤如下：96孔细胞板的前8列各孔加入100μL MH肉汤，在第1列各孔加100μL药物A，依次倍比稀释至第8列，最后吸出100μL加入第9列，同样在第一行前8孔各加100μL药物B，依次倍比稀释至第8行，最后在前10列各孔加入100μL制备好的菌悬液，37℃培养16h～24h后，计算FIC。因大观霉素、环丙沙星对沙门菌、大肠埃希菌、标准菌株大肠埃希菌ATCC25922的MIC值均为该药的最小稀释浓度，故联合药敏试验只做其余的药物。此外，联合药敏试验只做标准菌株大肠埃希菌ATCC25922。

2 结果

蠔猪刺、乌樟和抗菌药物对沙门菌和大肠埃希菌的MIC范围、MIC50和MIC90如表1所示，从中可以看出，蠔猪刺和乌樟对沙门菌和大肠埃希菌的最小抑菌浓度均为1g／mL，其他抗菌药物对沙门菌和大肠埃希菌的最小抑菌浓度在NCCLS提供的质控范围内。

虽然蠔猪刺和乌樟对大肠埃希菌的最小抑菌浓度一样，但当两种中药分别与抗菌药物及另一种中药联合用药时，表现出不同的抗菌作用。从表2可以看出，蠔猪刺-红霉素、乌樟-红霉素、乌樟-替米考星、乌樟-林可霉素联合应用表现为相加作用；蠔猪刺-林可霉素，乌樟-蠔猪刺联合应用表现为无关作用；蠔猪刺-替米考星联合应用表现出无关作用。

表1 蠔猪刺、乌樟和抗菌药物对沙门菌和大肠埃希菌的MIC范围、MIC50和MIC90Table 1 MIC range，MIC50and MIC90of E.coli and Salmonellato Berberis julianae，Cinnamomum camphora and antimicrobials

表2 蠔猪刺、乌樟水提物和抗菌药物联合药敏试验结果Table 2 Combined antimicrobial susceptibility test results of Berberis julianae，Cinnamomum camphora and antimicrobials

3 讨论

3.1 煎煮过程对乌樟和蠔猪刺有效成分的影响

在煎煮过程中，乌樟和蠔猪刺中某些有效成分可能会有不同程度的损失，导致药物抑菌能力与抗生素相比不是十分理想，其主要原因是药物的有效成分不溶于水或者药物的有效成分性质不稳定，在遇到热源时易遭到破坏，导致其抑菌能力差，从而对试验结果造成一定影响，因此如何排除煎煮过程中各因素对中药抑菌效果的发挥至关重要。

3.2 水提法提取乌樟和蠔猪刺优缺点分析

水提法较其他提取方法具有设备简单、成本低、操作简便易行等优点，尤其是中药提取物往往是多种成分的混合物，抑菌效果可能是各种成分共同发挥作用的结果，因此水提法广泛应用于植物药材有效成分的初步提取。在本试验的预试验中，采用水提法对乌樟和蠔猪刺根、茎和叶子等不同部位分别进行提取比较，其抑菌效果相差不大，在一定程度上可以保证试验的顺利进行。

3.3 中草药饲料添加剂在畜牧生产中的应用

大量试验证实，中草药中含有蛋白质、糖类、酯类、维生素、微量元素、鞣质、色素、皂苷等物质［9-11］，具有增强机体免疫力、预防和治疗畜禽疾病、增进机体新陈代谢能力、促进蛋白质和酶的合成以及提高动物生产性能等多重功效［12-13］。针对乌樟和蠔猪刺分布区域比较广和采集方便等优点，我们设想是否可以考虑将蠔猪刺和乌樟作为中草药饲料添加剂，充分发挥其无毒、无害、低残留且不易产生耐药性的优点，还可大大增强家禽的免疫力，达到预防疾病的目的。因此，在下一步的试验中将继续研究其体内抑菌效果以及其对细菌性感染疾病的防治，从而为其后续研究奠定一定基础。

［1］ 李永秋，周贵德.抗生素在兽医临床上应用存在的问题及其对策［J］.养殖技术顾问，2012（4）：243.

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