L-抗坏血酸没食子酸酯的酶催化合成及抗氧化性

范广璞，刘菊香，刘长春

(江苏食品药品职业技术学院生物与化学工程学院，江苏 淮安，223003)

没食子酸(GA)广泛存在于葡萄、茶叶、五倍花、刺云实豆荚等植物中，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的药理作用和较强的抗氧化作用［1-3］，主要用于食品、医药、有机合成等领域。没食子酸酯类化合物具有优良的抗氧化性能［4］，其中没食子酸丙脂经FAO/WHO组织批准已用作食品抗氧化剂，其抗氧化性能较BHT(二丁基羟基甲醚)和BHA (丁基羟基茴香醚)等强，耐热性好，广泛用于肉腌制品、罐头制品、鱼类制品、饼干、糕点、油脂以及油炸食品等。

L-抗坏血酸(LAA)是一种具有抗氧化作用的水溶性维生素，可用作食品的抗氧化剂、护色剂等，但是其水溶性限制了它在油脂行业中的应用。L-抗坏血酸酯不仅保持了L-抗坏血酸的抗氧化性能和生理活性，而且在非水体系中的溶解性和稳定性均有显著提高，增加了对自由基的清除能力，已经成为一种高效、安全、无毒的抗氧化剂［5］。L-抗坏血酸酯主要通过化学法和酶法合成。化学法合成是在浓硫酸、SO42- /ZrO2等催化剂作用下将L-抗坏血酸和羧酸或羧酸酯经直接酯化或酯交换得到L-抗坏血酸酯［6-8］，反应产率低，环境污染严重。酶法合成则是采用脂肪酶作催化剂合成L-抗坏血酸酯［9-11］，反应条件温和，产物选择性高，安全无毒。根据没食子酸的抗菌性能和较强的抗氧化作用，我们将没食子酸活性结构单元引入L-抗坏血酸分子中，采用脂肪酶催化合成具有良好脂溶性的L-抗坏血酸没食子酸酯，并考察了其抗氧化性能，希望获得一种兼具抑菌活性和抗氧化活性的多功能食品添加剂。

1 材料与方法

1.1 原料

没食子酸、L-抗坏血酸、4Å 分子筛，上海国药集团化学试剂有限公司;固定化脂肪酶Novozym435，诺维信(中国)生物技术有限公司;其他所用试剂均为市售分析纯或化学纯。

1.2 主要仪器设备

Nicolet 5-DX 红外光谱仪，KBr 压片，美国Nicolet公司;AVANCE 400 核磁共振仪，TMS 作内标，CDCl3作溶剂，瑞士Bruker 公司;X-4 型显微熔点仪，北京泰克仪器有限公司;722S 型分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 L-抗坏血酸没食子酸酯的合成

1.3.1.1 合成方法

将没食子酸1.7 g (10 mmol)、L-抗坏血酸3.5 g(20 mmol)、环己酮20 mL 和固定化脂肪酶Novozym435 0.25 g 依次加入三口烧瓶中，水浴加热至50 ℃，搅拌反应12 h 后，加入4Å 分子筛15 mg 继续反应12 h。冷却至室温，过滤，滤液用饱和食盐水洗涤(10 mL×3)，减压蒸馏除去溶剂，残留物用环己烷重结晶，得到白色固体L-抗坏血酸没食子酸酯，m. p.155 ～157 ℃。1H NMR(CDCl3)δ:3.55(s，1H，OH)，4.28 ～4.53(m，3H，OCH2，OCH)，5.01(d，1H，COOCH)，5.38(s，3H，ArOH)，6.95 (s，2H，ArH)，11.06(s，2H，= COH);IR(KBr，cm-1)υ:3370，2955，1713，1648，1451，1169。

1.3.1.2 反应条件的确定

(1)反应溶剂:在没食子酸10 mmol、L-抗坏血酸20 mmol、脂肪酶0.25 g、50 ℃反应24 h 的条件下，分别以甲苯(toluene)、氯仿(chloroform)、叔丁醇(tertbutyl alcohol)、叔戊醇(tert-pentyl alcohol)和环己酮(cyclohexanone)作溶剂，按1.3.1.1 中方法进行试验。

(2)反应物用量:在没食子酸10 mmol、脂肪酶0.25 g、环己酮20 mL、50 ℃反应24 h 的条件下，改变L-抗坏血酸用量为10、15、20、25 mmol，按1.3.1.1 中方法进行试验。

(3)脂肪酶用量:在没食子酸10 mmol、L-抗坏血酸20 mmol、环己酮20 mL、50 ℃反应24 h 的条件下，改变脂肪酶用量为0.15、0.20、0.25、0.30 g，按

1.3.1.1 中方法进行试验。

(4)反应温度:在没食子酸10 mmol、L-抗坏血酸20 mmol、脂肪酶0.25 g、环己酮20 mL、反应24 h 的条件下，改变反应温度为30、40、50、60 ℃，按

1.3.1.1 中方法进行试验。

(5)反应时间:在没食子酸10 mmol、L-抗坏血酸20 mmol、脂肪酶0.25 g、环己酮20 mL、50 ℃的条件下，改变反应时间为12、18、24、30、36 h，按1.3.1.1中方法进行试验。

1.3.2 抗氧化性能的测定

按文献［12］测定L-抗坏血酸没食子酸酯对羟基自由基和DPPH 自由基的清除活性，并与L-抗坏血酸的清除活性进行比较。

1.3.2.1 清除DPPH 自由基活性测定

将样品用无水乙醇配制成浓度为1.0 mmol/L 溶液，分别吸取10、20、40、60、80、100 μL 加入1.5 mL离心管中，用无水乙醇稀释至650 μL，混合均匀后加入0.16 mmol/L DPPH 无水乙醇溶液350 μL，放置30 min，用1 cm 比色皿于517 nm 处测量各样品溶液(浓度分别为10、20、40、60、80、100 μmol/L)的吸光度(A)。以不含样品的溶液为空白，根据测得的吸光度(A)按下式计算目标化合物对DPHH 自由基的清除率，平行测定3 次，计算平均值和标准偏差。按同样方法测定L-抗坏血酸对DPHH 自由基的清除率。

1.3.2.2 清除羟基自由基活性测定

将样品用无水乙醇配制成浓度为50 mmol/L 溶液，然后在1.5 mL 离心管中加入7.5 mmol/L 邻二氮菲无水乙醇溶液100 μL，7.5 mmo l/L FeSO4水溶液100 μL，样品溶液分别取20、40、80、120、160、200 μL，体积分数0.1% 的H2O2溶液100 μL，用0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH =7.4)稀释至1.0 mL。在37 ℃下保温1 h，用1 cm 比色皿于536 nm 处测定各样品溶液(浓度分别为1、2、4、6、8、10 mmol/L)的吸光度(A)。以不含样品的溶液为对照，不含样品和H2O2的溶液为空白，根据测得的吸光度(A)计算目标化合物对羟基自由基的清除率，平行测定3 次，计算平均值和标准偏差。按同样方法测定L-抗坏血酸对羟基自由基的清除率。

2 结果与讨论

2.1 L-抗坏血酸没食子酸酯的合成

在不同的有机溶剂中脂肪酶的活力差别很大，由于亲水性的有机溶剂会夺取酶周围微环境的必需水，导致脂肪酶失活，从而不利于反应的进行，所以使用疏水性的有机溶剂较好。不同有机溶剂对非水介质中脂肪酶Novozym 435 催化合成L-抗坏血酸没食子酸酯的影响结果见表1。由表1 可知，脂肪酶Novozyme 435 在环己酮反应介质中有很好的催化活性，所以环己酮是酶催化合成L-抗坏血酸没食子酸酯的最适合有机溶剂。环己酮的用量为20 mL 时，没食子酸的转化率达到最高;环己酮的用量较少，反应中生成的水对反应平衡和酶活性的影响较大，使没食子酸的转化率降低;而环己酮用量过多，没食子酸转化率稍有下降，且溶剂回收处理量大;因此环己酮的适宜用量为20 mL。

表1 溶剂的影响Table 1 Effect of solvent on the yield of conversion rate of gallic acid

图1 反映了反应物用量对没食子酸转化率的影响。可以看出，使用过量的L-抗坏血酸有利于反应的进行，随着L-抗坏血酸用量的增加，没食子酸的转化率逐渐增加，但是当L-抗坏血酸用量增加到20 mmol 后，没食子酸的转化率无显著增加。

图1 反应物用量对没食子酸转化率的影响Fig.1 Effect of reactant amount on the conversion rate of gallic acid

图2 为脂肪酶用量对没食子酸转化率的影响。由图2 可知，增加脂肪酶的用量可以增加催化活性中心，使反应速度加快，没食子酸的转化率得以提高。当催化剂用量大于0.25 g，可能是过多的酶使反应初始生成的水量增多，不利于反应的进行，同时过多的水还会导致酶失活，使没食子酸的转化率稍有降低。

图2 脂肪酶用量对没食子酸转化率的影响Fig.2 Effect of lipase amount on the conversion rate of gallic acid

反应温度对没食子酸转化率的影响见图3。从图3 可以看出，反应温度对反应的影响较大。反应温度过低，反应不能进行完全，没食子酸的转化率较低。反应温度过高，由于L-抗坏血酸不稳定易氧化，使没食子酸的转化率下降。所以，适宜反应温度为50 ℃。

图4 为没食子酸转化率随反应时间的变化情况。可以看出，延长反应时间有利于酶催化反应进行完全，没食子酸的转化率不断增加。当反应时间达到24 h 后，继续延长反应时间，没食子酸的转化率无明显变化。

2.2 抗氧化活性

图3 反应温度对没食子酸转化率的影响Fig.3 Effect of reaction temperature on the conversion rate of gallic acid

图4 反应时间对没食子酸转化率的影响Fig.4 Effect of reaction time on the conversion rate of gallic acid

将L-抗坏血酸没食子酸酯配制成不同的浓度，测定其对DPPH 自由基和羟基自由基的清除活性，并与L-抗坏血酸进行比较，结果见图5 和图6。结果表明，随着样品浓度的增加，DPPH 自由基和羟基自由基的清除率均明显增加。L-抗坏血酸没食子酸酯浓度为60 μmol/L 时，对DPPH 自由基的清除率为90.3%。L-抗坏血酸没食子酸酯浓度为8 mmol/L时，对羟基自由基的清除率为92.8%。

图5 L-抗坏血酸没食子酸酯对DPPH 自由基的清除活性Fig.5 DPPH radical scavenging activity of L-ascorbyl gallate

应用Excel 处理实验数据，得到试验样品清除DPPH 自由基和羟基自由基的模拟方程如下:

L-抗坏血酸没食子酸酯清除DPPH 自由基的模拟方程为:

图6 L-抗坏血酸没食子酸酯对羟基自由基的清除活性Fig.6 Hydroxyl radical scavenging activity of L-ascorbyl gallate

式中:y 为清除率，%;x 为浓度，μmol/L。R2=0.9817，计算得IC50=9.97 μmol/L。

L-抗坏血酸清除DPPH 自由基的模拟方程为:

式中:y 为清除率，%;x 为浓度，μmol/L。R2=0.9807，计算得IC50=23.55 μmol/L。

L-抗坏血酸没食子酸酯清除羟基自由基的模拟方程为:

式中:y 为清除率，%;x 为浓度，mmol/L。R2=0.9956，计算得IC50=2.45 mmol/L。

L-抗坏血酸清除羟基自由基的模拟方程为:

式中:y 为清除率，%;x 为浓度，mmol/L。R2=0.9951，计算得IC50=5.14 mmol/L。

从试验样品清除DPPH 自由基和羟基自由基的IC50数据可知，L-抗坏血酸没食子酸酯具有优良的抗氧化活性，能有效清除DPPH 自由基和羟基自由基，清除效果明显好于对照样品L-抗坏血酸，清除DPPH自由基能力比清除羟基自由基强。

3 结论

在固定化脂肪酶Novozym 435 催化下没食子酸和L-抗坏血酸直接酯化合成了L-抗坏血酸没食子酸酯，成功地将没食子酸与L-抗坏血酸两个活性结构单元结合在一起。反应条件温和，产物选择性高，安全无毒，开发了一种合成新型食品添加剂的新方法。抗氧化性测试结果表明，L-抗坏血酸没食子酸酯可以有效清除DPPH 自由基和羟基自由基，清除效果明显好于L-抗坏血酸，L-抗坏血酸没食子酸酯清除DPPH自由基和羟基自由基的IC50分别为9.97 μmol/L 和2.45 mmol/L，L-抗坏血酸清除DPPH 自由基和羟基自由基的IC50分别为23.55 μmol/L 和5.14 mmol/L。因此，L-抗坏血酸没食子酸酯是一种潜在的多功能食品添加剂。

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