豆渣发酵酱油关键技术*

张梦茹，刘美蓉，朱娜丽，全明明，张宝善

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安，710119)

豆渣是大豆产品加工过程中的副产品，约占全豆的15% ～20%。其营养成分高于众多槽渣，含有丰富的蛋白质、脂肪、膳食纤维、异黄酮、B 族维生素以及钙、铁、锌、钾等多种微量元素。研究表明，每100 g干豆渣中含有水分8.31 g，蛋白质19.32 g，脂肪12.40 g，纤维素51.8 g，灰分3.54 g［1-2］，是典型的低热能高植物蛋白的食品资源，更是一种很重要的天然膳食纤维资源。但是豆渣的能量含量低、含水量较高、保质期短等特性使其再利用受到一定限制。在我国，传统利用方式是将豆渣作为饲料，直接喂养动物;在日本，大量的豆渣被焚烧掉;在香港，豆渣通常作为废弃物堆放。这样不仅使其营养成分大量流失，同时也造成了环境污染。因此，如何更好地利用豆渣成为急需研究和解决的问题。

因此，本实验以豆渣代替豆粕为原料，发酵生产我国传统的发酵调味品酱油。传统的酱油是采用低盐固态发酵法以大豆为原料，经过熬制、发酵、淋取等工艺制成。其原料昂贵，且发酵曲种单一，导致蛋白质分解不足，利用率较低。近年来，多采用多菌种制曲发酵工艺，如利用米曲霉和黑曲霉混合制曲，弥补因单一菌种酿造酱油而使蛋白质分解不足的缺陷。原料处理方面，对原料进行酶解处理，采用纤维素酶［3］，破坏原料细胞壁，释放出蛋白质和淀粉，利于发酵进行，同时还可以起到增加色度并提高还原糖的作用。本实验在传统低盐固态发酵的基础上，采用米曲霉与黑曲霉双菌混合发酵生产酱油，可望扩充酱油的生产原料来源，并提高豆渣的利用率。

研究证实，原料配比、菌种配比、高压蒸煮时间、盐水浓度和冷热杀菌对成品品质都有不同程度的影响。因此，本实验主要对这5 个因素进行探究优化，通过单因素实验和正交试验，最终得到豆渣发酵生产酱油的最佳工艺参数，并且对 成品进行感官、理化和卫生指标的检验分析。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料

黄豆豆渣:自制豆渣;麦麸;豆粕;市售食盐

发酵菌种:米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)，来自于陕西师范大学食品发酵实验室。

1.1.2 设备

LX-B50L 不锈钢蒸汽消毒器，上海民桥精密科学仪器有限公司;GHX-9080B-1 型隔水式恒温培养箱，上海福玛试验设备有限公司;JY301 型电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司;GZX-914MBE型数显鼓风干燥箱，上海民桥精密科学仪器有限公司;SW-CJ 型超净工作台，上海雷钧试验仪器制造有限公司;PHS-3C 型精密PH 计，上海精密科学仪器有限公司;Kjeltec 2300 全自动凯氏定氮仪，瑞典福斯公司;JTMX-LHS-100SC 恒温恒湿培养箱，北京中西远大科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 菌种的制备

将米曲霉(黑曲霉)接入斜面试管上，控制培养温度为30℃，恒温培养48 h 至长满厚密的黄绿色孢子(褐黑色孢子);再将培养好的斜面菌种接入三角瓶中培养，摇匀，控制培养温度为30℃，恒温培养20 h，瓶内麸皮曲料发白结饼，摇瓶一次，摇碎结块，再过4 h 再摇瓶1 次，继续培养至48 h，整个麸皮曲料全部变为黄绿色(黑色)，三角瓶中已培养好。

1.2.2.2 制曲

将所需原料按实验设计配比混合均匀，按照原料干基∶水(m∶m)=1∶2 润水后于121℃下灭菌，冷却至30℃左右，按实验设计分别接种米曲霉和黑曲霉，30 ～32℃［4-5］分别制曲36h［6］。

1.2.2.3 混合发酵

将成曲混合均匀后按照干料∶食盐水(m∶m)=1∶2.5 加入进行发酵，发酵结束后，浸出滤油，分别评价酱油的感官特性，测定全氮含量、氨基酸态氮、可溶性无盐固形物含量。

1.3 豆渣发酵酱油工艺参数的确定

1.3.1 原料配比对发酵酱油品质的影响

选取豆渣和麸皮，将其按照不同比例分为4 组:

(1)豆渣∶麸皮=8 ∶2;(2)豆渣∶麸皮=7 ∶3;(3)豆渣∶麸皮=6∶4;(4)豆渣∶麸皮=5∶5

1.3.2 菌种配比对发酵酱油品质的影响

采用米曲霉与黑曲霉接种量4∶1 混合、米曲霉与黑曲霉接种量3∶1 混合、米曲霉与黑曲霉接种量1∶1、米曲霉与黑曲霉接种量1∶3 混合混合这4 种方式进行发酵。

1.3.3 高压蒸煮时间对发酵酱油品质的影响

选取高压蒸煮时间为20、30、40、50 min 进行研究。

1.3.4 盐水浓度对发酵酱油品质的影响

选取盐水浓度分别为6%、8%、10%、12%对其进行研究。

1.3.5 冷杀菌与热杀菌对发酵酱油品质的影响

采用冷杀菌技术(超声波杀菌、微波杀菌)对酱油灭菌，并与传统热杀菌技术比较，检测成品酱油的稳定性，确定最佳杀菌方法和工艺参数。

1.3.6 豆渣发酵酱油工艺参数的优化

参考以上单因素实验结果，采用L9(43)正交表进行正交试验。

1.4 测定方法

1.4.1 发酵过程中酱油全氮含量变化的测定

从制曲开始到发酵结束整个过程中，隔天取样。用全自动凯氏定氮仪对样品中的全氮含量进行测定。

1.4.2 发酵过程中酱油氨基酸态氮含量变化的测定

从制曲开始到发酵结束整个过程中，隔天取样。按照GB/T 5009139 -2003 中甲醛值法对样品中的氨基酸态氮含量进行测定。

1.4.3 发酵过程中酱油可溶性无盐固形物含量测定

酱油中总固形物含量减去NaCl 含量即为可溶性无盐固形物含量。NaCl 含量的测定采用GB/T 5009139 -2003。

1.4.4 感官特性评定方法

根据《GB 18186 -2000 酿造酱油》，结合豆渣发酵酱油自身的特点，以色泽、香气、滋味和体态这四项作为指标，每项25 分，总分100 分。具体评分标准如表1 所示。

表1 豆渣发酵酱油的感官特性评分标准Table 1 The sense evaluation standard of Fermenting soy sauce using bean dregs

1.4.5 理化特性评定方法

根据《GB 18186 -2000 酿造酱油》，结合豆渣发酵酱油自身的特点，以可溶性无盐固形物、全氮含量、氨基酸态氮含量这3 项作为指标。具体标准见表2。

表2 豆渣发酵酱油的理化指标Table 2 The physical and chemical index of fermenting soy sauce using bean dregs

1.4.6 卫生指标评定方法

我国酱油的卫生标准经过了1996 年、1981 年、2003 年的多次修订，目前按《GB 2717 -2003 酱油卫生标准》执行。具体的微生物指标见表3。

表3 豆渣发酵酱油的微生物指标Table 3 The microbiological indicator fermenting soy sauce using bean dregs

2 结果与分析

2.1 原料配比对豆渣发酵酱油品质的影响

原料配比是影响豆渣发酵酱油品质的一个重要因素。根据预实验结果分析，选择豆渣四个不同水平的添加量对制曲物料配比做进一步优化。豆渣发酵酱油的最佳接种量为干料量的0.1% ～0.3%，保持培养温度28 ～30℃制曲，在成曲中按1∶2 加入食盐水，45℃培养发酵。

表4 原料配比对豆渣发酵酱油品质的影响Table 4 The effect of ratio of raw materials on fermenting soy sauce using bean dregs

由表4 可知，当原料配比为m(豆渣)∶m(麸皮)=6∶4 时，酱油中全氮含量、氨基酸态氮含量、可溶性无盐固形物含量及感官评定均优于其他组。原料配比按m(豆渣)∶m(麸皮)=7∶3 发酵制成的酱油理化指标均高于原料比为5∶5，但是感官评定略低于原料比为5∶5。因此，当原料配比在7∶3 与6∶4 之间时，豆渣发酵酱油的品质最佳。

2.2 菌种配比对发酵酱油品质的影响

米曲霉产生中性蛋白酶的能力比较强［7-8］，生成酸性蛋白酶的能力较弱，而酱油的发酵过程一般都处于偏酸条件下，这就对蛋白质的分解利用造成一定困难，而黑曲霉不但能产生较多的酸性蛋白酶，而且能产生米曲霉不能产生的纤维素酶、柚甘酶等多种酶。所以利用米曲霉和黑曲霉混合制曲，能够弥补单一米曲霉酿造酱油酸性蛋白酶活力太弱的不足，使酱醅中各种酶的比例更趋合理，从而提高氨基酸的生成率，原料的全氮利用率和出品率［9］。所以本实验采用混合菌种制曲。在双菌制曲中，适宜的菌种配比对酱油的品质有很大的影响。在上述2.1 的恒定条件下，豆渣与麸皮质量比6∶4 混合，根据预实验的结果，选取米曲霉和黑曲霉比例分别为4∶1 ，3∶1 ，1∶1 ，1∶3对其进行优化研究。

由表5 显示，随着米曲霉所占比例的增大，全氮含量、氨基酸态氮含量、可溶性固形物含量、感官评分均增大。当米曲霉与黑曲霉按4∶1 混合时，酱油的氨基酸态氮和可溶性固形物含量最高，当米曲霉与黑曲霉按3∶1 混合时，酱油中的全氮含量最高。当米曲霉和黑曲霉质量比为1∶3 时，虽然提高了氨基酸生成率，但会影响全氮的利用率，并且4 项指标均低于其他组。所以黑曲霉的用量不能过多，要以米曲霉为主要发酵菌种。故豆渣发酵酱油的最佳菌种配比介于3∶1 和4∶1 之间。

表5 菌种配比对酱油品质的影响Table 5 The effect of proportion of different bacteria on fermenting soy sauce using bean dregs

2.3 高压蒸煮时间对发酵酱油品质的影响

按原料m(原料干基)∶m(水)=1∶2.5 润水，在高压蒸汽灭菌锅内进行高温蒸煮(固定蒸煮温度为121℃，蒸煮时间设定4 个考察点:20 、30 、40 、50 min)、接种、发酵。实验结果如表6 所示。

表6 高压蒸煮时间对发酵酱油品质的影响Table 6 The effect of high pressure cooking time on fermenting soy sauce using bean dregs

蒸煮的主要目的是使原料中蛋白质分子发生适度变性，露出蛋白质分子内部的氨基酸支链，使其容易进行酶水解，同时达到杀菌的目的。如果蒸煮时间、温度不足，蛋白质分子未达到一次变性，会产生曲霉蛋白酶不能分解的N 性物质。在高温、长时间蒸煮后，一方面，蛋白质分子会发生过度变性，不能为曲霉蛋白酶所分解;另一方面，蛋白质分子会与糖分子发生褐变反应，从而降低氮的利用率，损失一部分氨基酸［10］。

由表6 可知，当蒸煮时间小于30 min 时，理化指标和感官评定随着时间延长而呈上升趋势，但当高压蒸煮时间大于30 min 时理化指标和感官评定随着时间延长而呈下降趋势。因此，豆渣发酵酱油原料的最佳蒸煮时间为30 min 左右。

2.4 盐水浓度对发酵酱油品质的影响

在豆渣发酵酱油过程中，向成曲中拌入盐水的主要作用是防止发酵过程酱醅被杂菌污染，但过高的盐水浓度会抑制蛋白酶的作用，使得发酵时间延长［11-12］。根据预实验的结果，选取浓度分别为6%、8%、10%、12%、14%的盐水对酱醅进行发酵。对发酵过程中样品的理化指标和感官评定测定如表7 所示。

表7 盐水浓度对发酵酱油品质的影响Table 7 The effect of brine concentration on fermenting soy sauce using bean dregs

实验过程中发现，当盐水浓度低于8%时仍有杂菌生长，导致酱油色泽暗淡，酱香味不浓，略有异味。但当盐水浓度高于12%时，又会抑制酶的活性，延长发酵时间，降低原料中氮的利用率，同时由于抑制产香有益菌的生长，导致其香味很淡，从而影响酱油的质量。由表2 ～表4 可知，盐水浓度为12%时酱油中全氮含量最高，在该盐水浓度下成曲中蛋白质分解最好，氨基酸态氮形成也最高，但可溶性无盐固形物含量稍低。故豆渣发酵酱油的最佳盐水浓度为12%左右。

2.5 冷杀菌与热杀菌对发酵酱油品质的影响

酱油生产中传统的杀菌和抑菌技术主要是采用热杀菌和添加防腐剂的方法［13］。但是这2 种杀菌方法也有很多不足的地方，热杀菌容易导致酱油中热敏营养成分的破坏，例如氨基酸和一些香气成分，使酱油颜色褐变严重，不容易控制酱油的色泽，也会使有害副产物增多，以及具有能耗大等缺点。添加防腐剂容易给酱油带来食品安全危害。而冷杀菌技术是具有能杀死微生物，对食品营养、质构、色泽和风味影响较小的杀菌技术［14］。

设置4 组实验，采用冷杀菌技术(超声波杀菌、微波杀菌)对酱油灭菌，并与传统热杀菌技术比较，检测成品酱油的稳定性，确定最佳杀菌方法和工艺参数。1 号不做任何处理，作为空白对照;2 号组为超声波杀菌，频率为20 kHz，灭菌时间为20 min，当杀菌时间累计达到4 min 时，所灭菌的酱油微生物菌落总数达到了合格指标;3 号组为微波杀菌，在37℃实验温度下，微波输出功率为720 W，样品厚度20 cm，微波处理时间4 min，所灭菌的酱油微生物菌落总数达到了合格指标;4 号组为超高温瞬时灭菌，135℃杀菌5 s，所灭菌的酱油微生物菌落总数达到了合格指标。

原料配比为豆渣∶麸皮=6∶4，菌种配比米曲霉∶黑曲霉=4∶1，发酵温度为45℃，盐水浓度为12%，蒸煮时间为30 min。发酵结果如下表:

表8 杀菌方法对发酵酱油品质的影响Table 8 The effect of sterilization methods on fermenting soy sauce using bean dregs

从表8 可看出，超声波杀菌和微波杀菌与超高温瞬时灭菌相比，对酱油的香气成分的破坏较小、氨基酸损失较少，护色效果好。但高温杀菌灭菌彻底，保鲜期长，弥补冷杀菌方法灭菌不彻底，保鲜期不长的缺点。因此采用冷杀菌与热杀菌相结合的灭菌方法对酱油进行灭菌处理。

2.6 豆渣发酵酱油工艺参数的优化

为了确定豆渣发酵酱油最佳生产工艺参数，在以上单因素实验的基础上，以原料配比、菌种配比、高压蒸煮时间和盐水浓度为试验因素，感官评定为指标，采用L9(43)正交表(表9)进行正交试验。试验结果分析见表9。

表9 豆渣发酵酱油正交试验因素水平表Table 9 The factors and levels of fermenting soy sauce using bean dregs

表10 豆渣发酵酱油工艺参数确定实验结果分析Table 10 The result of fermenting soy sauce using bean dregs’technology parameter and analysis of rang

3 结论

(1)麸皮添加量的多少影响酱油的色泽和鲜味，当豆渣与麸皮质量比为6∶4 时，成品酱油氨基酸态氮含量高，酱油有光泽，酱香味浓郁。

(2)利用米曲霉和黑曲霉混合制曲，能够弥补单一米曲霉酿造酱油酸性蛋白酶活力太弱的不足，当米曲霉与黑曲霉接种比例为4∶1 时，蛋白酶活力强，原料全氮利用率高，氨基酸生成率高。

(3)当蒸煮时间为30 min 时，原料中蛋白质分子发生适度变性，露出蛋白质分子内部的氨基酸支链，使蛋白质容易进行酶水解，同时达到杀菌的目的。酱油品质较高。

(4)盐水浓度为12%时酱油中全氮含量最高，在该盐水浓度下成曲中蛋白酶活力强，蛋白质分解最好，氨基酸态氮形成也最高。

(5)冷杀菌与热杀菌相比，对酱油的香气成分破坏较小、氨基酸损失少，护色效果好。但高温灭菌彻底，保鲜期长，弥补冷杀菌方法灭菌不彻底，保鲜期不长的缺点，因此建议将冷杀菌作为酱油的辅助消毒或协同灭菌，冷热杀菌相结合的灭菌方法对将有进行灭菌。

(6)通过正交试验对发酵豆渣酱油的工艺参数进行优化，确定豆渣酱油的最佳工艺参数。结果表明，制曲原料配比为豆渣∶麸皮=6∶4，原料干基∶水(m∶m)= 1∶2.5 润水;最佳发酵条件为米曲霉∶黑曲霉(m∶m)=4∶1，发酵温度45℃，盐水浓度12%，发酵时间为15 d。成品达到了《GB18186 -2000 酿造酱油》低盐固态发酵法二级酱油的标准。

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