发酵木糖产酒精菌株的筛选和驯化

李力群，陈英伟，王德信，姜海静，唐志涛

(1.吉林化工学院环境与生物工程学院，吉林 吉林132022;2.吉林沱牌农产品开发有限公司 技术部，吉林 吉林132000)

生物资源是地球上最丰富的可再生资源.随着矿产资源日渐枯竭，开发高效转化可再生纤维素物质的微生物技术，炼制生物燃料，具有极其重要的意义和广阔的发展前景.我国农业生产中形成的各种秸秆，每年约有7亿吨.在玉米秸秆等植物纤维水解液中木糖约占25% ～30%，木糖的充分利用是植物纤维资源生产酒精经济可行性的关键之一［1］.将木糖转化为酒精，在理论上可提高酒精产量25%［2］，因此选育优良的木糖发酵酒精菌种势在必行.

本文从土壤中筛选出了可发酵木糖为酒精的菌株M-12#，对其进行了初步研究，为后续研究奠定了基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土样

分别采自吉林市九站经济技术开发区农田和吉林化工学院校园.

1.1.2 培养基

YEPD液体培养基:酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，木糖 20 g/L，蒸馏水1 L，pH 为 5.0，120 ℃灭菌30 min.

YEPD固体培养基:酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，木糖20 g/L，琼脂粉20 g/L，蒸馏水1 L，pH为5.0，120℃灭菌30 min.

发酵培养基:木糖20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨 15 g/L，(NH4)2SO41 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl2·2H2O 1 g/L，H2O 1 L，120℃灭菌30 min.

1.1.3 主要仪器、试剂和测定方法

主要仪器和设备 YP-600型精密电子天平，UV-2000型紫外可见光分光光度计，生化培养箱，高压蒸汽灭菌锅，SW-CJ-2F型生物超净工作台，HYG-A型回转恒温调速摇瓶柜，SA23031型数码生物显微分析系统等.

主要试剂酵母浸粉，蛋白胨，木糖，琼脂粉、酵母膏、磷酸二氢钾、尿素、硫酸镁等试剂.

主要测定方法酒精含量测定采用重铬酸钾比色法［5］.木糖含量测定采用直接滴定法.生物量的测定采用血球计数板计数法和比浊法，在比浊法中，将发酵液混合均匀后稀释至一定倍数，测定其吸光度OD600.

2 实验方法与实验结果

2.1 木糖发酵酒精菌株的筛选

2.1.1 菌种初筛

取10 g土样加入到装有90 mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，震荡30 min，吸取5份10 mL悬浊液分别加入至90 mL YEPD液体培养基中放置摇床培养48 h，摇速140 r/min，温度30℃.富集后的菌液依次稀释至10-6、10-7、10-8浓度，每个稀释度吸取1 mL菌液均匀涂布到YEPD固体平板上，30℃培养48 h，对长出的菌落，进行复筛.

2.1.2 菌种复筛

TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)上层培养基:TTC 0.05 g，木糖0.5 g，琼脂1.5 g，H2O 100 mL.

TTC下层培养基:木糖10.1 g，蛋白胨2 g，酵母膏1.5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，柠檬酸 0.27 g，琼脂 20 g，H2O 1 L［3］.

将纯化的菌株接入到TTC下层培养基平板，30℃倒置培养两天，在长出的菌落上倒入TTC上层培养基覆盖，于30℃下避光保存3 h，根据不同的菌落颜色等差异进行筛选［4］.

将筛选出来的菌株接入装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，在30℃、120 r/min条件下进行发酵，48 h后挑出酒精浓度高的摇瓶，将菌液稀释到相应的浓度，重复TTC法筛选，经过不断的发酵驯化和筛选，选育出酒精产量高的菌落.

2.2 菌种鉴定

经过复筛得到的菌株形态学特征:菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色均一，乳白色，表面光滑，容易挑起，不透明.液体培养形成菌膜和沉淀，细胞形态为卵圆柱形，主要以出芽方式繁殖，形成假菌丝，初步鉴定为霉菌，见图1～2.

图1 菌株形态

图2 菌落形态

2.3 生长曲线的测定

将菌株接入不同浓度木糖的发酵培养基中，在28℃，120 r/min条件下培养.利用血球计数板法和浊度法测定霉菌浓度.使用UV-2000型紫外可见光分光光度计，以灭菌的培养基为空白，比色皿厚度为5 mm，测定样品的OD600值 (注:空白与样品的稀释倍数一致).菌株的生长曲线测定结果见图3.

图3 菌株在不同木糖浓度培养基中的生长曲线

图3中的曲线表明，木糖浓度变化对霉菌的生长速度有明显的影响.

2.4 木糖发酵菌株的驯化

将菌株接种到木糖浓度30 g/L的100 mL发酵培养基中，在培养温度28℃，摇床转速为120 r/min条件下培养96 h.将TTC法筛选出发酵性能较高的菌株，再次接入木糖质量浓度为30 g/L的液体培养基中，同样条件下连续培养96 h.经过不断的发酵驯化和TTC方法筛选过程，不断提高菌株的木糖发酵酒精能力和发酵效率.

2.5 木糖发酵酒精性能实验

发酵培养基木糖浓度分别为20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L、70 g/L、80 g/L.250 mL 三角瓶中装量为100 mL.接种量为2 mL，pH 5.5，28℃，120 r/min摇床培养，每隔24 h测一次酒精度和残糖量.测实结果如图4～5所示.

图4 菌株木糖发酵酒精性能曲线

图5 菌株木糖发酵酒精时残糖量变化曲线

图5曲线趋势表明，当发酵液中的木糖浓度不高于3%时，残糖量较少，当木糖浓度高于3%时，残糖量与木糖浓度成正比.

其中木糖浓度30 g/L实验产酒精最多，其主要数据列于表1.

表1 木糖30 g/L时菌株酒精发酵实验数据

表1数据表明，当发酵至120 h时，酒精度达到峰值，为0.147%(v/v)，木糖转化率为0.045 g/g，为理论转化率的9.85%.

2.6 主要影响因素的探索实验

2.6.1 实验设计

分别以木糖浓度、发酵温度和发酵液pH值初值为影响因子，设计三因素三水平的正交实验，探索影响酒精发酵的主要因素之间的关系，因素和水平的设计见表2.

表2 因素水平设计表

2.6.2 实验数据

按实验的设计要求，每个实验有五个平行发酵培养基瓶，115℃下灭菌30 min.然后接入菌种进行发酵实验，测定不同时间的残糖量和酒精度，实验结果见图6.

图6 菌株木糖发酵酒精正交实验曲线

2.6.3 正交实验数据处理

采用直观分析法处理对图5中的酒精发酵正交实验数据进行极差分析，得到各因素的极差值:RA=1.908 7，RB=0.284 7，RC=0.078 5.通过比较极差数值的大小可知，最终影响霉菌木糖发酵酒精因素的强弱顺序为:

A(木糖浓度)＞B(发酵温度)＞C(发酵液pH初值).各因素的R值差异表明:木糖浓度对实验结果的影响最大，木糖浓度过高时有将产生严重的底物抑制;发酵温度的影响次之，而发酵液pH初值对实验结果的影响相对最小.

2.7 选育后的菌株发酵性能实验

采用L9(34)正交实验优化菌株的木糖发酵酒精工艺条件，因素和水平设计列于表3.

表3 因素和水平设计表

发酵温度:28℃;发酵时间:66 h;摇床速度:145 r/min;木糖3%，酵母膏0.1%，磷酸二氢钾0.05%，无水氯化钙0.025%，实验结果列于表4.

表4中实验4的发酵酒份最高，达到0.48%(v/v)，残糖 1.8%，摇瓶装量:90 mL/250 mL.木糖转化率为 0.316 g/g，达到理论转化率的68.6%.

表4 驯化后菌株发酵工艺优化正交实验

3 结 论

本工作从土壤是筛选得到了一株霉菌M-12#，其主要性能如下:

(1)该霉菌的菌落呈白色，边缘有缺刻，隆起，表面丝状向外散射，在显微镜下的菌株呈短粗杆状或棒状，两端比较圆滑.

(2)在驯化之前，当木糖浓度为30 g/L，发酵120 h，发酵酒精度达到峰值，为0.147%(v/v)，木糖转化率为0.045 g/g，为理论转化率的9.85%.

(3)经过二个月地不断驯化，筛选出来的菌株在木糖浓度为30 g/L的发酵液中，发酵66 h，酒精浓度提高了226%，达到0.48%(v/v)，转化率为0.316 g/g，为理论转化率的68.6%.

［1］Rodney JB，NancyN，Brace SD.Fermentations with new recombinant organisms ［J］.Biotechnol.Prog，1999(15):867-875.

［2］曹秀华，阮奇城，林海红，等.纤维燃料酒精生产中木糖发酵的研究进展，中国麻业科学［J］.2010，32(3):166-169.

［3］祖若夫，胡宝龙，周德庆.微生物学实验教程［M］.上海:复旦大学出版社，1993.

［4］王梅，张澎湃，帅桂兰.TTC在黄酒酵母选育中的应用［J］.酿酒，2001(5):62-64.

［5］林仁权，胡文兰，陈国亮.重铬酸钾氧化分光光度法测定酒中酒精含量［J］.浙江预防医学，2006，18(3):78-79.

［6］杜连祥.工业微生物学试验技术［M］.天津:天津科学技术出版社.1992，10.