复合微生物固态发酵豆粕的工艺条件研究

陈炳钿 周文艺 吴 焜 连建芸 李泳宁*

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所 福州 350013；2.福建新闽科生物科技开发有限公司 福州 350008）

近年来，随着饲料工业的不断发展，对蛋白饲料的需求量越来越大，同时由于捕捞过度等原因，造成鱼粉产量减少，使得可用作动物生产的蛋白质资源十分缺乏，供给的短缺使鱼粉价格居高不下，价格不断上涨。蛋白资源的缺乏，严重制约了我国饲料工业的发展，为了减少对鱼粉的依赖程度，具有高消化率的优质蛋白成为首选的替代品，而发酵豆粕就是其中一种。发酵豆粕具有较高的蛋白溶解度和较小的分子量，部分已达到小肽和氨基酸水平，有助于动物的消化吸收；同时发酵豆粕具有一定的芳香气味，适口性较好，且消除了豆粕中的抗营养因子，减少了对动物生长产生不同程度的抑制作用［1］。因此，优质的发酵豆粕已经开始部分取代鱼粉，并在畜禽和水产养殖业中发挥越来越重要的作用［2-4］。

豆粕的粗蛋白质含量较高，可达40%以上，且含多种氨基酸对畜禽摄入营养很有好处。但豆粕分子量较大，动物难以消化吸收，而且豆粕中含有抗营养因子，对动物的健康和生产性能产生了不良的影响，采用酶解或微生物发酵技术进行处理可以破坏其抗营养因子，分解大分子蛋白为小分子多肽，可有效提高蛋白质在动物体内的消化率［5-6］。

目前微生物发酵技术常采用曲霉、芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌等其中的一种或几种的混合发酵工艺［7-9］，虽然能去除其中的抗营养因子，但混合发酵工艺控制难度大，豆粕蛋白的水解程度较低；同时多数发酵豆粕常用三氯乙酸可溶性氮来表征多肽含量，而未对其多肽的分子量进行表征。本试验研究了一种新的复合微生物固态发酵工艺，根据所选菌株的生长代谢特性采用了先好氧后厌氧的固态分阶段发酵工艺，并进行了条件优化，最终得到含有活性益生菌、乳酸和小分子肽的生物活性饲料，产品发酵豆粕中88.94%的多肽分子量小于2 300 Da，而且其中大部分达到小肽和氨基酸的水平，是一种优质的蛋白产品。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、酿酒酵母本实验室保藏。

1.1.2 原料与试剂 豆粕购于福海粮油公司，豆粕粉碎并过80 目筛；玉米和麸皮均购于市场；其他试剂均为分析纯。

1.2 种子培养基配方

地衣芽孢杆菌液体培养基（g/L）：葡萄糖10、蛋白胨5、硫酸镁1.5、磷酸二氢钾1.5，水1 000 mL，pH7.0。

酿酒酵母液体培养基（g/L）：葡萄糖30、蛋白胨5、氯化钾0.5、磷酸二氢钾1.0、硫酸镁0.5、硫酸锌0.1、硫酸铁0.1，水1 000 mL，pH7.0。

嗜酸乳杆菌液体培养基（g/L）：葡萄糖20、蛋白胨10、牛肉膏10、酵母膏5、磷酸二氢钾2、醋酸钠5、柠檬酸铵2、硫酸镁0.2、硫酸锰0.2、吐温80 1.0，水1 000 mL，pH6.2。

1.3 固态发酵培养基配方 固态发酵培养基的基质成分及配比（%）：豆粕95、麸皮4、硫酸铵0.1、磷酸氢二钾0.1、硫酸镁0.1、氯化钠0.2、葡萄糖0.5。

1.4 发酵工艺 试管斜面→三角瓶→5 L 发酵罐→接种至固态发酵基质→固态浅盘发酵→检测。好氧发酵阶段采用通过管道直接向恒温洁净室内通入无菌空气，厌氧发酵阶段则关闭通气，恒温发酵。

1.5 检测项目 菌体量测定：液体菌数采用显微镜血球板计数法，发酵豆粕则采用平板法计数。蛋白含量：采用凯氏定氮法，参照GB/T 6432-1994 饲料中粗蛋白测定方法。乳酸含量测定采用山东省科学院生物研究所生物传感分析仪（SBA-40E）进行测定。多肽含量测定采用三氯乙酸可溶性氮（TCA-NSI）法，参照文献［9］测定方法。多肽分子量测定采用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定。

2 结果与讨论

2.1 复合微生物菌剂配比对豆粕发酵的影响 将地衣芽孢杆菌、酿酒酵母和嗜酸乳杆菌液体发酵后的菌种按下述比例混匀后，按10%接种量添加到已灭菌固态发酵基质上，并补入一定量无菌水至含水量为50%，采用浅盘好氧发酵工艺进行发酵，发酵后产物取样进行分析检测，结果见表1。

表1 复合微生物菌剂配比对固态发酵的影响

由表1 可以看出，三种菌株不同配比下发酵豆粕中的粗蛋白含量没有显著差异。当配比中地衣芽孢杆菌的含量较高时（2：1：1）×109，发酵后产物中多肽含量和总菌数均最高，这主要是由于地衣芽孢杆菌具有较快的生长速率和较高的产酶能力，在接种至固态培养基质后，快速生长且产生大量胞外酶能有效降解豆粕，多肽含量最高达16.27%。而当酵母菌和嗜酸乳杆菌含量较高时，会影响地衣芽孢杆菌的生长代谢，对蛋白的分解效果不佳，但代谢产乳酸的能力较强，乳酸含量较高，分别达到2.50%和2.89%。因此，综合考虑各种指标，当地衣芽孢杆菌、酿酒酵母和嗜酸乳杆菌的配比在（2：1：1）×109时可获得较好的协同生长代谢的作用，发酵产物的各项指标均达到较优的水平，本试验选择（2：1：1）×109作为后续试验的配比组成进行研究。

2.2 复合微生物接种量对豆粕发酵的影响 将上述优化配比后的菌种复配后，按5%、10%、15%、20%的接种量接入固态发酵基质，采用浅盘好氧发酵工艺法进行发酵，发酵后产物取样进行分析检测，结果见图1。

图1 复合微生物接种量对豆粕发酵的影响

从图1 可以看出，当接种量从0～10%时，随着接种量的增大，发酵后产物中的多肽含量显著增加，当接种量达到10%时，多肽含量达到15.78%，再增大接种量时，产物中的多肽含量增加并不明显。而从粗蛋白含量来看，在不同接种量条件下进行发酵，随着接种量的增大，发酵后产物中的粗蛋白含量也随之增加，但差别并不显著，在接种量为20%时的粗蛋白含量最高，达到52.86%。此外，在接种量高时由于菌数量较高大，胞外酶活较高，随着小分子蛋白的进一步降解，产生了脱氨的现象，发酵后产品酸味较重，气味刺鼻、脱氨严重。因此，综合考虑发酵效果及成本，采用10%接种量进行后续试验。

2.3 含水量对豆粕发酵的影响 将复合微生物菌剂按10%接种量接种至固态培养基质上，分别补入一定的无菌水，控制含水量为40%、45%、50%、55%和60%，采用浅盘好氧发酵工艺进行发酵，发酵后产物取样进行分析检测，结果见图2。

图2 含水量对豆粕发酵的影响

从图2 可以看出，当含水量为40%时对豆粕降解的降解效果较差，发酵豆粕中多肽含量较低，仅有14.36%。增加含水量到45%时多肽含量的增加显著，45%含水量下的多肽含量达到17.21%，再增大含水量多肽含量略有下降，但当含水量达到60%时，多肽含量则显著下降，仅达到14.52%。不同含水量对固态发酵过程中总菌数也有显著影响，当含水量为45%时，微生物总菌数仅1.26×109，随着含水量的增加，微生物总菌数显著增加，当含水量为50%时，微生物总菌数最高达到2.06×109，通过镜检观察，产物中地衣芽孢杆菌菌体生长旺盛。再增加含水量，总菌数略有下降，主要是由于含水量较高时不利于固态发酵中好氧发酵过程的通气，导致地衣芽孢杆菌的生长代谢受到影响，但其发酵产物中酵母菌和嗜酸乳杆菌数明显增加，细胞的生长和代谢活性较强，pH 值显著下降。从发酵产物的形态看45%水分发酵产品亮黄色、质地干散，易于干燥；而60%含水量时为金黄色、芳香味、质地良好，产物结块严重，不易于干燥。因此，综合考虑发酵产物的质量和干燥成本，选择45%含水量进行后续的试验。

2.4 好氧厌氧发酵阶段对固态发酵的影响 在上述优化条件下，根据微生物菌种特性进一步分阶段进行固态发酵，采用了好氧厌氧分阶段发酵法，考察在不同菌种发酵特性下对固态发酵的影响，结果见表2。

表2 好氧厌氧发酵阶段对固态发酵的影响

从表2 可以看出，培养过程中好氧和厌氧发酵阶段的时间变化对粗蛋白含量并无显著差异。但随着好氧培养时间的增加，明显有利于改善接种后菌体的生长，好氧培养24 h、48 h和72 h的发酵产物中总菌数均达到20 亿以上，其中通过镜检观察，多数为地衣芽孢杆菌，可见，在前期增加好氧时间，有利于地衣芽孢杆菌的生长。而在纯厌氧条件下有利于嗜酸乳杆菌的生长，因此，其最终产物中的乳酸含量较高，达到2.87%，pH 值也降到4.61 左右。从多肽含量来看，好氧阶段在48 h 以上时可获得较好的降解效果，多肽含量均达到17%以上，其中48 h的多肽含量最高，达19.22%。而纯好氧培养条件下有利于地衣芽孢杆菌的生长，但地衣芽孢杆菌过量生长，大量地分泌胞外酶，随着固态发酵的进行，最终形成脱氨，导致总氮含量下降，发酵产物的氨味重，无酒香味，适口性变差。因此，在固态发酵中增加一定的厌氧发酵时间有利于酵母菌和嗜酸乳杆菌的生长，其代谢产生乙醇和乳酸等代谢产物使得发酵产物芳香味浓，酸味强，增加了产物的适口性。

综合三种益生菌株在固态发酵过程所起的作用和作用阶段的特点，采用好氧48 h、厌氧24 h的固态发酵工艺可获得较好的发酵效果。2.5 发酵豆粕中多肽的分子量分布 将发酵豆粕中可溶性多肽进行液相色谱分析，采用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定多肽的相对分子量。以蛋清白蛋白（43 000 Da）、牛血清白蛋白（67 000 Da）和匙孔贝血蓝蛋白（350 000 Da）为标准蛋白作标准曲线进行分析，牛血清白蛋白和发酵豆粕中多肽的液相色谱图见图3-图4。

图3 牛血清白蛋白液相色谱图

图4 发酵豆粕中多肽液相色谱图

以三种标准蛋白的分子量对数和出峰时间作标准曲线，可得方程y=-1.1701x+24.939（R2=0.997）。从发酵豆粕中多肽的液相色谱图中可以看出，其出峰时间均大于20 min，且大部分蛋白出峰时间均在21 min 后。通过标准曲线的方程计算，20.022 min 出峰蛋白的分子量约为16 000 Da，约占多肽蛋白含量的11.06%。而其他大部分蛋白出峰时间均在21 min之后，其相对分子量约为2 300 Da，占88.94%，多数在22 min 后出峰，其相对蛋白分子量约为320 Da。可见发酵豆粕中88.94%的多肽分子量小于2 300 Da，而且其中大部分达到小肽和氨基酸的水平，是一种优质的蛋白产品。

3 结论

试验分别采用液体发酵制备地衣芽孢杆菌、酿酒酵母和嗜酸乳杆菌的菌种，将3 种微生物菌株按一定的比例接种于豆粕进行固态发酵，优化的发酵工艺条件为，地衣芽孢杆菌、酿酒酵母和嗜酸乳杆菌的配比在为（2：1：1）×109，接种量为10%，含水量为45%。采用好氧48 h、厌氧24 h的固态发酵工艺，发酵产物中总菌数可达2.18×109cfu/g，，乳酸含量达2.51%，多肽含量达到19.22%，其中88.94%的多肽分子量小于2 300 Da，而且其中大部分达到小肽和氨基酸的水平。

由此可见，根据三种益生菌株在固态发酵过程所起的作用和作用阶段的特点，采用好氧48 h、厌氧24 h的固态发酵工艺可获得较好的发酵效果，明前期好氧阶段有利于地衣芽孢杆菌的生长代谢，产生大量的酶类和其他生物活性物质，后期转为厌氧后，酿酒酵母和嗜酸乳杆菌成主导作用菌群，进一步生长代谢和降解固态基质，并产生乙醇和乳酸等生物活性物质。发酵产物多肽含量高，且多数达到小肽和氨基酸水平，同时含有大量的活性微生物和乳酸等生物活性物质，是一种优质的微生物酵解活性肽产品。

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