多重PCR快速检测猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型方法的建立

谢燕婷

（厦门银祥集团 肉食品安全生产技术国家重点实验室 福建厦门 361000）

猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2 型常呈混合感染，在临床上以受感染母猪产死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔猪为主要特征，同时能导致疫苗免疫失败，诱发继发感染［1］。目前，对于病毒性疫病的诊断一般采用病原分离鉴定和血清学方法［2］，但这些方法存在操作繁琐、耗时长、敏感性差等不足，当猪群感染多种病原时，难以应用常规方法进行早期快速检测和鉴别诊断。而多重PCR 方法可以在一份样品中同时检测出多种病原，对多种疾病进行同步诊断，具有快速、敏感、特异、经济等优点。

1 材料与方法

1.1 病毒与细胞 猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2 型（PCV2）由福建省农业科学院畜牧兽医研究所畜病室惠赠。

1.2 主要试剂 Taq DNA 聚合酶、琼脂糖购于宝生物工程（大连）有限公司，Dneasy Blood&tissue kit 购于德国Qiagen，AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒购于美国Axygen，Endo-free Plasmid Mini KitⅠ质粒提取试剂盒购于美国Omega，TOPO TA Cloning Kit 购自厦门英韦创津生物科技有限公司。

1.3 引物设计 根据Genbank 上发表的序列，引物选择PRV gB 基因、PCV2 ORF2 基因为其扩增靶序列，借助Primer Premier 5.0 及DNAstar 软件筛选设计出符合多重PCR 要求的2 对引物［3-4］。引物由厦门英韦创津生物科技有限公司合成，合成引物于-20 ℃保存。引物序列如下：

SuHV-1：5’CGATGGGGTAGTAGTGCT3’，3’GA ACCTCTGCGTGAACGG5’；

PCV2：5’GAGTAGTTTACATAGGGGTCA3’，3’ATTGCGGAGGAACCTATGC5’。

1.4 病毒DNA的提取 根据Dneasy Blood&tissue kit 提取试剂盒说明书操作步骤进行病毒核酸的提取。

1.5 mPCR 方法的建立 mPCR 反应在50μL 体系中进行，包括10×PCR bufer（Mg2+Free）5μL，2.5 mM dNTP 4μL，MgCl225 mM 3μL、单个病毒的各自上下游引物10μM 各1μL，TaqTM DNA 聚合酶5 U/μL 0.25μL，用去离子水补足50μL，于PCR 仪上扩增。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃30 s，57.9 ℃45 s，72 ℃1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。取5μL 扩增产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

2 试验结果

2.1 PCR 产物的克隆、鉴定结果 对PRV、PCV2的重组质粒进行PCR 鉴定，PRV、PCV2 分别为373 bp与430 bp，与预期目的片段一致。将测序结果与Genbank 上收录的序列进行BLAST 比较，结果表明扩增片段分别为各自病毒的特异性条带。

2.2 mPCR 反应最佳退火温度的确定 将混合好的反应体系在不同的退火温度条件下进行mPCR反应（见图1），退火温度分别为60.0 ℃、59.3 ℃、57.9 ℃、56.2 ℃、54.9 ℃、54.0 ℃、53.5 ℃。从图1 可以看出，mPCR的最佳退火温度为57.9 ℃。

2.3 单重PCR 及多重PCR的特异性试验 扩增产物的大小，由琼脂糖凝胶电泳试验确定，结果表明PRV为373 bp，PCV2为430 bp，见图2-图3。以双蒸水、PRV、PCV2、PPV、PRRSV、CSFV 病毒为模板分别进行mPCR 反应，结果表明双蒸水、PPV、PRRSV、CSFV 病毒均未扩增出条带，见图4。

图1 不同退火温度的PCR 反应

图2 PRVPCR 敏感性试验

图3 PCV2 PCR 敏感性试验

图4 单重PCR、多重PCR 反应及特异性试验

2.4 PCR 扩增的敏感性试验 将提取的PRV、PCV2 质粒用岛津的紫外风光光度计UV-1800 中的DNA 定量功能测定核酸浓度，经过十次重复试验得出PRV 质粒核酸浓度为161.75 ng/μL，PCV2 质粒核酸浓度146.94 ng/μL。用灭菌双蒸水进行l0倍倍比稀释，取10倍倍比稀释的病毒质粒做模板分别进行单个病毒PCR 反应和进行病毒mPCR 反应，检测其敏感性。结果表明，在单个病毒的PCR 反应中，单个病毒PCR 反应检测限量为1.47×10-8～1.62×10-6ng；在病毒mPCR 反应中，病毒mPCR 反应的检测限量为1.47×10-6～1.62×10-4ng，见图5。

图5 多重PCR 敏感性试验

3 讨论

在mPCR 反应中，引物的设计至关重要，决定mPCR 反应成功与否［5］。本研究从Genbank 上分别下载了21 株PCV2 基因和2 株PRV 基因，通过DNAstar 进行比对，引物的设计是针对以上2 种病毒各自保守的区域，分别为PCV2 ORF2 基因及PRV gB 基因，在最保守的区域设计引物。多重PCR扩增时，反应体系中各组分的浓度及反应条件直接影响试验效果。因此，在多重PCR 扩增前需对PCR扩增的各种反应条件进行优化，使每个病毒的引物长度为18～21 bp，G+C 含量在40%～55%，Tm 值尽量一致，避免引物二聚体及发卡结构。在敏感性试验中，通过将单个病毒PCR的敏感性与mPCR的敏感性进行比较，结果表明，4 种病毒的mPCR 敏感性相对减少了2个稀释倍数，但其核酸检测可至1.47×l0-6～1.62×10-6ng，仍然具有很强的敏感性。而多重PCR 特异性试验结果显示，对双蒸水、猪细小病毒（PPV）、猪繁殖与障碍综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）多重PCR的扩增结果均为阴性，作为临床上猪伪狂犬病、猪圆环病毒2 型感染的病原学快速诊断方法具有可行性。

［1］曲光刚，沈志强，管宇，等.PRV、PCV-2、PPV 多重PCR检测方法的建立及其应用［J］.中国动物检疫，2009，26（1）：23-25.

［2］李维华，任慧英，刘文，等.PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV 复合PeR的应用研究［J］.西北农业学报，2008，17（3）：12-15.

［3］Fengxiong Yue，Shangjin Cui，Chaofan Zhang，et al.A multiplex PCR for rapid and simμLtaneous detection of porcine circovirus type 2，porcine parvovirus，porcine pseudorabies virus，and porcine reproductive andrespiratory syndrome virusin clinical specimens［J］.Virus Genes，2009，38：392-397.

［4］Hirohito Ogawa，Osamu Taira，Takuya Hirai，et al.Multiplex PCR and mμLtiplex RT-PCR for inclusive detection of majorswine DNA and RNA viruses in pigs with multiple infections［J］.Journal of Virological Methods，2009，160（1/2）：210-214.

［5］岳丰雄，崔尚金，冉多良，等.多重PCR 方法用于检测猪圆环病毒2 型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒诊断方法的建立［J］.养猪，2010（3）：41-44.