蛋氨酸脑啡肽对GM-CSF诱导的小鼠骨髓来源树突状细胞TLR-4和TNF-α表达影响

刘金玲，单风平

（1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，沈阳 110866；2.中国医科大学免疫教研室，沈阳 110001）

树突状细胞（Dendritic cell，DC）是目前所知机体内功能最强大的抗原提呈细胞，参与机体多种自身免疫性疾病、免疫缺陷病、肿瘤及炎症反应病理过程，在机体抗感染免疫及肿瘤免疫应答过程中起着有重要作用[1]。Toll样受体（Toll like receptors，TLRs）是一种模式识别受体，在细胞活化信号转导中起重要作用，是联系天然免疫与获得性免疫桥梁。研究表明，TLR4（Tol-l like receptor 4）可直接或间接结合病原体，通过细胞吞噬和内化活动，将病原体及其产物清除，还可诱导防御素和NO表达，因此TLR4在天然免疫中起重要作用[2-4]。

肿 瘤坏死因子-a（Tumor Necrosis Factor-a，TNF-a）是一种主要由活化单核巨噬细胞和T淋巴细胞产生多效性细胞因子，主要作用于免疫细胞调节，可诱导细胞凋亡，炎症反应及抑制肿瘤和病毒复制，在疾病感染过程中有重要监测意义[5-6]。蛋氨酸脑啡肽（Methionine Enkephalin，MENK）联系神经、免疫两大系统，是重要细胞因子，具有独特生物学活性，机体免疫细胞表面广泛存在其受体[7-8]，MENK通过与受体相互作用增强天然免疫系统细胞如自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞和获得性免疫系统细胞如T细胞活性，促进细胞因子释放等，从而起到免疫调节作用[9]。

关于MENK对树突状细胞功能研究，国内外鲜有报道，本试验通过体外诱导培养骨髓来源树突状细胞，观察蛋氨酸脑啡肽对GM-CSF诱导的骨髓来源树突细胞表达TLR-4和TNF-α影响，探明TLR4和促炎症因子TNF-α表达变化情况，从而探讨蛋氨酸脑啡肽对树突状细胞免疫功能作用调节机制，为临床研究提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

6～8周C57BL/6小鼠（购自上海实验动物研究所）；RPMI-1640完全培养基（含L-谷氨酰胺）、胎牛血清（购自Hyclone公司）；荧光素标记的小鼠单抗：CD11c-FITC（购自Biolegend公司）；重组小鼠GM-CSF（rmGM-CSF），IL-4（购 自 Biolegend 公司）；分装后于-20℃保存备用；蛋氨酸脑啡肽（MENK）由中国医科大学免疫学教研室提供；RT-PCR Kit、TRIzol、琼脂糖（购自TaKaRa公司）；兔抗鼠TNF-α，兔抗鼠TLR-4多克隆抗体、SABC、DAB显色试剂盒（购自武汉博士德公司）；二抗IgG-HRP（购自美国Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将7～8周龄的正常C57BL/6鼠颈椎脱位处死，无菌条件下取完整股骨、胫骨，用RPMI-1640培养液将骨髓细胞冲出，收集骨髓细胞悬液经离心，红细胞裂解再次离心后将细胞用RPIM1640培养基悬浮，分装6孔培养板，每孔106个·mL-1。每孔中别加入不同诱导剂置于含5%CO2，饱和湿度，37℃培养箱中培养，隔天半量换液，并用倒置显微镜观察不同时间点树突状细胞形态变化。

1.2.2 试验分组

在培养的过程中，将细胞分为如下各组，施以不同的刺激条件。①RPMI-1640空白对照组；② GM-CSF（10 ng·mL-1）、 IL-4（5 ng·mL-1）和MENK （10～12 mol·L-1）共刺激组（MENK+G+I）；③ GM-CSF（10 ng·mL-1）和 IL-4（5 ng·mL-1）组（G+I）。培养至第7天，用吸管轻轻吹打后收集所有悬浮细胞，经流式细胞仪鉴定BM-DCs的纯度。

1.2.3 RT-PCR法检测树突状细胞TLR-4和TNF-αmRNA的表达

利用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物，引物均由TaKaRa公司合成，PCR引物见表1。

1.2.3.1 细胞总RNA的提取

各组细胞加入TRIzol裂解液，转移到1.5 mL离心管中，加入0.2 mL氯仿，离心，吸取上层水相，加等量的异丙醇沉淀RNA，离心，缓慢加人750 μL乙醇洗涤，离心，空气风干后加入DEPC水溶解。紫外分光光度计测定波长260及280 nm RNA A值，计算RNA的浓度和纯度，取0.5 μg RNA用于RT-PCR。

1.2.3.2 cDNA合成

20 μL 体系中含，10×RT Buffer 2 μL，MgCl2（25 mmol·L-1） 4 μL，RNase Inhibitor（40 U·μL-1）0.5 μL，dNTP Mixture（10 mmol·L-1）1 μL，Oligo（dT）-Adaptor Primer 1 μL（2.5 pmol·μL-1）， RNase Free dH2O 6.5 μL，总RNA样本1 μL，AMV Reverse Transcriptase 1 μL（5 U·μL-1）。反应条件：30 ℃ 10 min，65℃ 50 min，95℃ 5 min，5℃ 5 min。

表1 PCR引物Table 1 PCR primer

1.2.3.3 半定量RT-PCR

在 25 μL 体系中含 RNase Free dH2O 12.5 μL，5×PCR Buffer 5 μL，TNF-α，TLR-4及β-actin的上下游引物各 0.5 μL，cDNA 5 μL，Taq酶 0.5 μL，dNTP Mixture（10 mmol·L-1）1 μL。循环参数为94 ℃预变性2 min，94℃变性30 s，退火温度30 s，72℃延伸30 s，30个循环，72℃延伸10 min 4℃保存。

各组取10 μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在Gelpro32凝胶成像系统上进行分析，以各组目的基因条带和相应β-actin条带光密度的比值作为相应基因mRNA的相对定量表达水平。

1.2.4 ELISA法检测树突状TNF-α蛋白的表达

每组做4个复孔。各组处理结束后收集培养液于酶标板，37℃孵育2 h，PBS清洗2次，加鼠源TNF-α抗体 100 μL·孔-1，37 ℃孵育 2 h，洗板 3次，加抗鼠HRP-IgG 100 μL·孔-1，37 ℃孵育1 h，洗板，分别加显色液A和B各50 μL·孔-1，37℃孵育 15 min，加终止液 100 μL·孔-1。酶标仪在450 nm波长处检测各孔吸光度。

1.2.5 Western-Blot检测TLR-4蛋白的表达

收集各组培养的成熟的BM-DC，加入2×SDS裂解后，取50 μg蛋白质样品加入到样品孔中进行SDS聚丙烯酸胺凝胶电泳，然后根据凝胶面积按300 mA接通电流进行转膜、封闭、兔抗鼠TLR-4一抗孵育过夜，兔抗鼠IgG-HRP抗体（1∶2 000稀释），孵育2 h，最后用DAB显色剂进行显色。

1.2.6 统计学处理

用SPSS（17.0）统计软件对数据进行处理，数据以平均值±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 BM-DCs纯度的流式细胞仪鉴定

取各诱导组细胞悬液0.1 mL至流式管中，加入荧光标记的CD11c-FITC，混匀，4℃避光染色，洗涤后上机检测，结果显示MENK+G+I组树突状细胞的纯度为95.09%，高于G+I组（90.89%），而1640对照组的纯度只有9.08%。表明MENK在体外能够增加骨髓来源树突状细胞的诱导纯度（见图1）。

图1 各组树突状细胞纯度流式分析Fig.1 Purity analysis of DCs by FCM

2.2 MENK对GM-CSF和IL-4诱导的骨髓来源树突状细胞TNF-α和TLR-4mRNA的影响

RT-PCR结果表明经MENK与GM-CSF和IL-4（MENK+G+I）协同诱导骨髓来源树突状细胞TNF-α和TLR-4 mRNA的表达均增多，其中TLR-4 mRNA丰度值与1640对照组相比具有极显著性差异（P＜0.01），与GM-SCF和IL-4（G+I）诱导组相比差异显著，具有统计学意义（P＜0.05），而TNF-αmRNA丰度值（大于1640对照组，差异极显著（P＜0.01），与G+I组相比差异显著（P＜0.05)。上述数据表明MENK可以从基因水平上调树突状细胞TNF-α和TLR-4的表达（见图2、3）。

图2 各组骨髓来源树突状细胞TNF-α和TLR-4 mRNA表达的RT-PCR结果Fig.2 RT-PCR analysis at mRNA levels of of TNF-α and TLR-4 for BM-DCs

图3 各组骨髓来源树突状细胞TNF-α和TLR-4 mRNA表达的RT-PCR结果Fig.3 Analysis of histogram at abundance of TNF-α and TLR-4 for BM-DCs

2.3 MENK对GM-CSF和IL-4诱导的骨髓来源树突状细胞TNF-α蛋白表达的影响

结果表明，与RPMI1640对照组相比，MENK+G+I组中TNF-α水平有极显著提高（P＜0.01）；与G+I组相比差异显著（P＜0.05），数据表明，MENK可上调的细胞因子TNF-α，MENK-12定向诱导Th1型细胞反应（见表2）。

表2 MENK对G+I诱导骨髓来源树突装细胞TNF-α表达的影响Table 2 Effect of MENK on TNF-α of BM-DCs induced by GM-CSF and IL-4

2.4 MENK对GM-CSF和IL-4诱导的骨髓来源树突状细胞TLR-4蛋白表达的影响

收集不同诱导条件下培养的成熟的BM-DCs，提取蛋白质后，采用Western-Blot方法从蛋白水平检测BM-DCs TLR-4的表达情况。结果表明，MENK+G+I组诱导培养的BM-DCs其TLR-4蛋白的表达丰度明显高于RPIM-1640对照组，差异极显著（P＜0.01），高于G+I组，差异显著（P＜0.05），提示MENK可上调BM-DCs TLR-4蛋白的表达（见图4）。

图4 体外诱导骨髓来源树突状细胞TLR-4的表达Fig.4 Expression of TLR-4 of BM-DCs in vitro

3 讨论与结论

DC是免疫应答启动因子和调节因子，是T、B细胞有效刺激因子。近年来，DC在机体免疫系统中重要作用显现，在移植排斥反应、肿瘤免疫治疗、感染性疾病和自身免疫性疾病等的诊治方面均有研究报道，同时对DC生物学特性、与某些疾病发生、预后等关系也有进一步深入研究[10-11]。成熟DC表达高水平的主要组织相容性复合体（MHC）分子，并能分泌白细胞介素-l（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、干扰素-a（IFN-α）、肿瘤坏死因子a（TNF-a）等细胞因子[12]，其中TNF-α是TNF家族重要成员之一，是具有广泛生物学活性的细胞因子，能诱导炎症因子产生导致细胞凋亡[13]。

Toll样受体是一种模式识别受体，广泛分布在免疫细胞表面，在细胞活化信号的转导中起重要作用，是联系天然免疫与获得性免疫的桥梁，能特异性地识别病原体相关分子模式，激发动物天然免疫和获得性免疫的早期免疫反应，这种特性使Toll样受体成为诱导有效免疫反应对抗病原或自身异常重要候选基因，而Toll样受体4（TLR-4）是机体对革兰氏阴性菌表达的脂多糖应答的主要受体，TLR-4活化后，激活NF-κB等转录因子，可引起TNF-α、NO等多种炎症介质和细胞因子的表达和释放[14]，并激活获得性免疫，在炎症反应中发挥重要作用。

MENK是一类联系神经、免疫两大系统，通过作用到免疫细胞阿片受体上发挥生物学活性细胞因子。Burger等证实MENK具有增强NK细胞活性、刺激的T细胞增殖、显著增强CTL细胞活性[15]、刺激大鼠腹腔巨噬细胞H2O2和NO产生，协助巨噬细胞杀菌和抗肿瘤、调控IL-2、IL-1、IL-4和IFN-γ等细胞因子分泌及抑制细胞生长功能。MENK对免疫系统的调控功能已被大量体外、体内试验所证实[16]。

本试验发现经MENK刺激后，骨髓来源树突状细胞纯度为95.09%，高于1640对照组和G+I组，而且TLR-4和TNF-α表达在基因水平和蛋白水平均显著增加，与其他试验组相比差异显著，具有统计学意义。TNF-α处于炎症级反应中心环节，是TLR4/NF-κB信号通路中下游信号，TNF-α表达量多少是MENK发挥免疫调节作用进而干预肿瘤、病毒发生、发展的靶分子之一。

本试验结果提示，在MENK诱导作用下BM-DC增加阿片受体表达，从而上调TLR-4表达。这一现象与活化后DCs在亚群、表型和细胞因子分泌模式等方面差异性有关，但其确切机理尚待进一步阐明。综上，树突细胞表面的阿片受体是介导小鼠DCs活化的重要模式识别受体，间接通过上调TLR-4表达从而激活NF-κb信号通路，上调Th1型细胞因子TNF-α等表达，诱导Th1细胞反应，进一步深入探讨MENK对树突状细胞免疫功能调控影响，为揭示MENK抗疾病作用机制提供试验依据。

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