黄酮化合物对金黄葡萄球菌β-内酰胺酶活性影响

刘立新，高月林，王朝兴，张羽男

（1.黑龙江省教育厅生物药制剂重点实验室，佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.黑龙江农业职业技术学院，黑龙江 佳木斯 154007）

随着抗生素被大量使用，耐药菌感染已成为21世纪医学领域面临重大挑战。近年来，临床分离葡萄球菌中耐甲氧西林菌株（MRSA）检出率越来越高，许多地区报道已超过80%，MRSA已成为感染重要病原菌，一旦发生流行，传播迅速，难以控制[1]。因此，研制新抗菌药物和逆转细菌耐药性新型药物制剂成为药学研究领域亟待解决难题之一。

β-内酰胺酶的产生是MRSA获得耐药性机制之一，这种酶可抵抗具有β-内酞胺环抗生素。研究发现[2]，含有黄酮类化合物中药如黄连、柴胡、苦参、黄芪、野菊花等，与抗生素联合应用能增加耐药菌对药物敏感性。本试验针对金黄葡萄球菌耐药性，应用体外抑菌试验筛选对MRSA有抑制作用黄酮类化合物，通过测定β-内酰胺酶活性来探讨黄酮类化合物逆转金黄葡萄球菌耐药性机制，为研发新型细菌耐药抑制剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

耐甲氧西林金黄葡萄球菌菌株由佳木斯大学附属第二医院提供。

1.1.2 药物

芦丁、姜黄素、槲皮素、木犀草素（均购自南京青泽医药科技发展有限公司）；黄连、柴胡、连翘等黄酮类化合物提取物（由佳木斯大学药学院天然药物化学实验室提供）；头孢他啶（购自哈药集团制药总厂）；克拉维酸（购自北京华业寰宇化工有限公司）。

1.1.3 试剂

蛋白胨、水解酪蛋白、牛肉浸膏、胰蛋白胨（均购自北京奥博星生物技术责任有限公司）。

1.1.4 仪器

SW-CJ-2DD单人双面净化工作台（购自苏州净化设备有限公司）；PYX-DH450电热恒温培养箱（购自上海玺恒实业有限公司）；Sunrise酶标仪（购自帝肯公司）。

1.2 方法

1.2.1 耐药菌株鉴定

1.2.1.1 细菌培养

将供试菌从平板培养基上挑取单个菌落接种于2 mL MH培养液，37℃培养16～18 h，参照比浊管使其生长浊度达9×108个·mL-1。放入4℃冰箱备用。

1.2.1.2 MRSA鉴定[3]

将供试菌接种到M-H琼脂平板上，再贴上1 μg苯唑青霉素纸片，置37℃恒温培养箱培养24 h观察结果，抑菌环直径≥13 mm为敏感菌，≤10 mm为耐药菌。

1.2.1.3 生物学鉴定

按全国临床检验操作规程进行。

1.2.2 逆转耐药性试验

1.2.2.1 最低抑菌浓度（MIC值）测定

采用试管二倍稀释法，将耐药菌液用MH培养液作1∶1 000稀释，将芦丁、姜黄素、槲皮素、木犀草素分别配置成浓度为1 mg·mL-1药液，将黄连、柴胡、连翘中提取黄酮类化合物配置成浓度为2 mg·mL-1药液，分别取7支试管，用菌液倍倍稀释，37℃恒温培养箱，培养16～18 h后观察结果，以无细菌生长最低浓度为最低抑菌浓度。

1.2.2.2 药敏试验

将各种黄酮类化合物配制成低于最低抑菌浓度药液，挑取耐药性金黄葡萄球菌于各药液中，37℃恒温培养时间24 h后，接种于平板培养基上使其生长。挑取生长良好单个菌落制成菌液，用无菌棉签均匀地涂布在M-H培养基上，待菌液稍干贴上苯唑青霉素药敏纸片，同时用不经逆转耐药金黄葡萄球菌作为阴性对照，经克拉维酸逆转作阳性对照。

1.2.3β-内酰胺酶提取[4]

将耐药金黄葡萄球菌接种于各种黄酮类化合物中，37℃恒温培养24 h，4℃ 10 000 r·min-1离心10 min。沉淀用PBS洗涤两次后，在-20～37℃反复冻融6次，4℃13 000 r·min-1离心60 min。留取上清液，为粗酶提取液，保存于-20℃冰箱备用。

1.2.4β-内酰胺酶活性测定[5]

头孢他啶是β-内酰胺酶最佳底物之一，β-内酰胺酶活性单位用每mg蛋白在37℃，pH=7.0时每分钟能水解底物毫克数表示。以100 mg·mL-1头孢他啶为底物，在96孔板中加入0.20 mL PBS缓冲液，0.06 mL头孢他啶，0.04 mL酶提取液，在波长482 nm处进行时间扫描，根据OD值变化求酶活性。

1.2.5 对照试验

选用克拉维酸作为阳性对照试验，选用不经逆转处理菌株作为阴性对照实验，其检测方法同上。

2 结果与分析

2.1 耐药菌株鉴定

供试菌再贴上1 μg苯唑青霉素纸片，37℃恒温培养箱培养24 h后，其抑菌环直径为8.9 mm，生物学鉴定血浆凝固酶阳性，V-P阳性，麦芽糖、甘露醇产酸，DNA酶阳性。鉴定结果为MRSA菌株[6]。

2.2 MIC值测定结果

各种黄酮类化合物对耐药金黄葡萄球菌最小抑菌浓度结果如表1。

2.3 药敏试验结果

将各黄酮类化合物配制成低于MIC值浓度，分别为：芦丁0.2 mg·mL-1，姜黄素0.2 mg·mL-1，槲皮素0.45 mg·mL-1，木犀草素0.45 mg·mL-1，黄连中黄酮类化合物0.6 mg·mL-1，柴胡中黄酮类化合物1.2 mg·mL-1，连翘中黄酮类化合物1.2 mg·mL-1，分别和耐药金黄葡萄球菌作用一段时间后药敏试验结果如表2。

由表2可见芦丁、姜黄素和槲皮素组与阴性对照组相比抑菌环直径差异显著（P＜0.05），说明逆转金黄葡萄球菌耐药性效果较好；与阳性对照组相比差异极显著（P＜0.01）；与其他各黄酮类化合物组别效果不显著（P＞0.05）。

表1 黄酮类化合物MIC值Table 1 MIC value of flavonoids compounds

表2 药敏实验结果Table 2 Medicine sensitive experiment results

2.4 β-内酰胺酶活性测定结果

根据药敏试验结果，可选取芦丁、姜黄素和槲皮素用于逆转耐药金黄葡萄球菌试验，提取β-内酰胺酶，测定酶活性，结果见表3。

表3 β-内酰胺酶活性测定结果Table 3 Detection results of β-lactamase activity

由表3可见，经芦丁、姜黄素和槲皮素培养耐药金黄葡萄球菌β-内酰胺酶活性降低，与阴性对照组相比差异极显著（P＜0.01）；与阳性对照组比较差异显著（P＜0.05）；芦丁、姜黄素和槲皮素各组间差异不显著（P＞0.05）。

3 讨论与结论

据报道MRSA由于其致病性强，己成为临床抗菌感染治疗难题之一，与艾滋病、乙型肝炎并列为世界三大严重感染性疾患[7]。目前，万古霉素是治疗MRSA感染最后一道防线，但临床上己发现耐万古霉素金黄色葡萄球菌[8]。研究低毒、有效耐药性抑制剂已在国际上引起广泛关注。由于中药具有无残留、作用靶位多、有效成分多、作用范围广及不易产生耐药性等优点，因此从中药中筛选耐药抑制剂成为极具前景的研究方向，为解决细菌耐药性难题开辟捷径。目前，国内外对于耐药金黄葡萄球菌中药耐药抑制剂研究报道主要集中于单方中药和复方中药制剂上，而对于中药有效成分逆转金黄葡萄球菌耐药性机制方面报道较少。

本试验选取中草药中普遍含有有效成分-黄酮类化合物为研究对象，其中包括纯黄酮化合物，如芦丁、姜黄素、槲皮素等；也包括不纯黄酮类化合物提取物，如黄连中黄酮类化合物和柴胡中黄酮类化合物等。研究发现将耐药金黄葡萄球菌分别接种于含以上黄酮类化合物培养液中作用一段时间后，金黄葡萄球菌恢复对抗生物敏感性，尤其以芦丁、槲皮素和木犀草素效果明显，而黄连和柴胡中黄酮类化合物效果不明显。试验结果说明黄酮类化合物能逆转细菌耐药性，纯黄酮类化合物逆转细菌耐药性效果比粗提黄酮类化合物效果显著。

β-内酰胺酶产生是细菌产生耐药性机制之一，其能将β-内酰胺类抗生素水解成无抑菌活性产物，使细菌获耐药性[9]。部分中药对目前临床上产生β-内酰胺酶菌株具有逆转耐药性作用。黄通旺等应用分光光度法测定大蒜、石芽茶等中草药提取液对耐青霉素细菌所产生β-内酰胺酶抑制作用[10]。结果表明，大蒜、黄柏提取液对β-内酰胺酶有不同程度抑制作用。三黄汤、黄连解毒汤、五味消毒饮对产酶大肠杆菌逆转机制也是通过抑制ESBLs活性和表达产生逆转效果[11]。何明等研究发现，肉汤菌经双黄连以及清开灵作用后细菌β-内酰胺酶活性都降低[12]。本试验选取药敏试验结果较好黄酮化合物芦丁、姜黄素和槲皮素进行β-内酰胺酶活性研究，结果表明，将耐药金黄葡萄球菌分别接种于含三种黄酮化合物培养液中作用一段时间后，β-内酰胺酶活性降低，根据β-内酰胺酶活性测定结果，说明黄酮类化合物能抑制β-内酰胺酶活性，阐明黄酮类化合物逆转金黄葡萄球菌耐药性机制。

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