三孢布拉霉菌发酵生产番茄红素的最佳条件的筛选

姜丰，王颖，汤华成，王宪青

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

番茄红素（Lycopene）是植物中所含的一种天然色素，1903年被SCHUNDC 发现并命名为Lycopene。主要存在于番茄、西瓜、柿子、胡椒果、木瓜、芒果、番石榴、葡萄、茶的叶片及萝卜、胡萝卜、芜菁、甘蓝等的根部中。番茄红色具有消除自由基和修复抗氧化能力[1-3]。 其抗癌防癌的功效突出，对于预防心血管疾病、动脉硬化等各种成人病[4]、增强人体免疫系统以及延缓衰老[5]等都具有重要意义。

目前，番茄红素的生产工艺主要有三种，国内外多采用天然提取的方法，包括有机溶剂萃取和超临界萃取，此外还有化学合成法和生物合成法[6]。采用生物合成法利用三孢布拉霉菌发酵生产番茄红素，与前两种方法相比较，这种方法具有不受季节限制、操作工艺简单、生产周期短、生产成本便宜，可相对的减少生产过程中污染的优点，并且可以得到较高的番茄红素得率，是实现工业化生产理想的一条途径[7]。

1 材料与方法

1.1 材料

三孢布拉霉正、负菌（武汉大学菌种保藏中心所）；番茄红素（北京澳天茂森生物技术研究院）；黄豆粉、玉米粉等（大庆 沃尔玛超市售）；硫酸镁、磷酸二氢钾、咪唑、B-紫罗酮（天津法埃莎化学有限公司）；维生素B1（天津市科密欧化学试剂有限公司）。

1.2 仪器

AR2140 型分析天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；VIS-721 紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；pH 计；DK-S11 电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）；DZF-6200 45 ℃真空干燥箱（上海和呈仪器制造有限公司）；HNY-200B台式恒温摇床（北京晨曦勇创科技有限公司）；LC1200 安捷伦液相色谱仪（太原市医达维科医药科技开发有限公司）；YM50A 电热式压力蒸汽消毒器（上海沪粤明科学仪器有限公司）。

1.3 主要方法

1.3.1 三孢布拉霉自身体内合成番茄红素的途径

三孢布拉霉通过利用葡萄糖等营养物质，在适宜的发酵条件作用下经过一系列反应后可生成β-胡萝卜素，而番茄红素作为胡萝卜素的母体化合物，要大量积累番茄红素就必须将反应控制在番茄红素水平，实验通过改变三孢布拉霉的培养条件和添加抑制剂来抑制环化酶的活性，从而阻断β-胡萝卜素生成途径的最后两步环化反应，以积累大量的番茄红素。

图1 三孢布拉霉自身合成番茄红素的途径Fig.1 The pathway of autosynthesis Lycopene from Blakeslea trispora

1.3.2 菌种的活化

保藏菌种在无菌条件下接入PDA 培养基，27 ℃培养24 h。

1.3.3 种子培养基的配制

将三孢布拉霉正负菌甘油保藏样为1∶10 的接种量接入PDA 培养基复苏培养，27 ℃，180 rpm，培养44 h。稳定传代3 次待用。

1.3.4 发酵培养基的配制

将对数生长期的正负菌按照1∶10 接入发酵培养基培养，pH 7.5，27 ℃发酵培养。24 h 后时加入发酵促进剂，42 h 时加入发酵阻断剂，180 rpm 在旋转式摇床振荡培养。

1.3.5 标准曲线的绘制及样品中番茄红素浓度的测定

分别准确称取经真空干燥的番茄红素标准品0.7、1.3、1.9、2.6、3.0、3.9、4.1 mg，各在10 mL 容量瓶中用氯仿迅速溶解稀释并加氯仿定容至刻度，摇匀，避光放置10 min，分别在721 型分光光度计上于518.8 nm 波长处，用1 cm 的比色皿，以氯仿作为参比，测得吸光度值，经7 次平行测定，取其平均的结果。以吸光度A 为纵坐标，番茄红素浓度C 为横坐标，绘制标准曲线，用最小二乘法进行线性回归。得回归方程：

A=0.269 7 C+0.058 9，此方程的相关系数r=0.999 6。吸取样品溶液1 mL 置于10 mL 容量瓶中，按上述方法测定样液中吸光度值，带入回归方程，求得样液中番茄红素的浓度[8]。

2 结果与讨论

2.1 不同碳源与氮源对番茄红素产量的影响

碳源对番茄红素发酵和菌体量的影响十分重要，主要用于构成菌丝体细胞物质和含氮的目的产物。在除碳源外其它成分不变的情况下，选取碳源浓度为1.8%的麦芽糖、葡萄糖、玉米粉、蔗糖和可溶性淀粉作为碳源平行发酵的比较，结果如图2 所示。在碳源浓度为1.8%的浓度时5 种碳源麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、玉米粉、可溶性淀粉对应的番茄红素的产量分别为0.79、0.95、0.83、1.19、0.99 g·L-1。与同类的碳源相比较玉米粉作为碳源产番茄红素的数值最高，并且玉米粉具有来源广泛、价格便宜，适用于大规模的工业化生产的优势。因此选取浓度为1.8%的玉米粉作为发酵的最佳碳源。

图2 不同碳源对番茄红素产量的影响Fig.2 Effect of different carbon sources on the Lycopene production

在除碳源外其它成分不变的情况下，在氮源添加浓度为4.4%，黄豆粉、玉米浆粉、棉籽饼粉、豆饼粉、蛋白胨5 种氮源进行发酵，结果如图3 所示。在氮源浓度为4.4%的浓度是5 种氮源黄豆粉、豆饼粉、棉籽饼粉、玉米粉、蛋白胨对应的番茄红素的产量分别为1.1、0.9、1.00、1.05、0.80 g·L-1。数据表明添加一定浓度的黄豆粉和玉米粉作为氮源，霉菌产番茄红素的量基本相同，但玉米粉作为氮源时菌液较为黏稠，主要以促进菌体生长为主，黄豆粉主要以促进番茄红素合成为主，这可能是因为玉米粉中除含有蛋白质和游离的氨基酸外，还含有少量的糖类、脂肪、维生素及某些生长因子，促使霉菌的生长过快。因此选取浓度为4.4%的黄豆粉作为发酵的最佳氮源。

图3 不同氮源对番茄红素产量的影响Fig.3 Effect of different nitrogen sources on the Lycopene production

2.2 不同接种比例对番茄红素产量的影响

番茄红素的生产菌主要是负菌，正菌在生产中主要起到诱导作用，因此接种量的大小对番茄红素发酵非常尤为重要。在当总的接种量不变时（20%），随着正负菌的接种比例从1∶5 增加到1∶40，得到的结果如图4 所示。在接种量为20%的情况下，按1∶10 混合后的比例接入发酵培养基，所得到的番茄红素产量最高为1.07 g·L-1。在接种比例为1∶5 时，菌体生长过于缓慢，不利于番茄红素的积累，随着接种比例在1∶10 后继续增大，菌体生长过快，发酵液变黏稠，菌株无法呼吸而导致菌体过早自溶，因此选择发酵的接种比例为1∶10。

图4 不同接种比例对番茄红素产量影响Fig.4 Effect of different inoculation ratio on the Lycopene production

2.3 发酵促进剂添加时间对番茄红素产量的影响

β-紫罗酮是一种性激素，β-紫罗酮作为三孢酸的结构类似物，如果在发酵过程中添加，可以诱导类胡萝卜素的合成。因此三孢布拉氏霉菌发酵过程中，在实验中选用β-紫罗酮作为发酵的促进剂，实验在发酵的12、24、36、48、60 h 时添加0.1%的β-紫罗酮，以番茄红素产量为指标，得出最佳的促进剂的添加时间。结果如图5 所示。

图5 发酵促进剂添加时间对番茄红素产量影响Fig.5 Effect of fermentation accelerator add time on the Lycopene production

在发酵过程中每隔12 h 向发酵液中添加浓度为0.7 mg·mL-1的β-紫罗酮，实验数据表明：相对于空白对照，发酵12 h 加入β-紫罗酮，菌体量由1.01 g·L-1提高到1.13 g·L-1，提高了11.9%，发酵24 h 加入β-紫罗酮，菌体量由1.01 g·L-1提高到1.26 g·L-1，提高了24.7%，发酵36 h 加入β-紫罗酮，菌体量由1.01 g·L-1提高到1.17 g·L-1，提高了15.8%，发酵48 h 加入β-紫罗酮，菌体量由1.01 g·L-1下降到0.95 g·L-1，发酵60 h 加入β-紫罗酮，菌体量由1.01 g·L-1下降到0.71 g·L-1。因此在发酵后的24 h添加0.1%的β-紫罗酮可使番茄红素的产量提高的程度最高为24.7%。实验结果与文献报道基本一致。

2.4 发酵阻断剂添加时间对番茄红素产量的影响

三孢布拉氏霉菌在发酵的过程中，添加含氮类杂环化合物会阻断类胡萝卜素合成代谢途径中的番茄红素环化反应，可以积累大量的番茄红素。因此在发酵的过程中阻断剂的添加时间对最后番茄红素的产量最为重要，通过查阅大量的文献表明在含氮类杂环化合物中咪唑的阻断效果最好，实验分别选择在发酵30、42、48、54、66 h 向发酵培养基中加入浓度为0.7 mg·mL-1的咪唑，番茄红素产量作为考察指标[9]。结果如图6 所示：不同时间段添加浓度为0.7 mg·mL-1的咪唑，番茄红素产量分别为0.82、0.96、1.22、1.04、0.87 g·L-1。发酵进行到42 h 时添加浓度为0.7 mg·mL-1的咪唑，番茄红素的产量最高。在18、32 h 加入咪唑阻断剂番茄红素的产量较低，这可能是由于过早的加入阻断剂对菌体产生了毒害的作用，不利于菌体的生长，致使番茄红素的产量较低，在48、54 h 时加入咪唑阻断剂番茄红素产量偏低，这可能是因为阻断剂的加入过晚，没有发挥阻断作用，一部分的番茄红素合成了β-胡萝卜素。因此选择发酵进行到42 h 时添加浓度为0.7 mg·mL-1的咪唑阻断剂。

图6 发酵阻断剂添加时间对番茄红素产量影响Fig.6 Effect of fermentation blockers add time on the Lycopene production

2.5 单因素试验

2.5.1 不同发酵pH 值对番茄红素产量的影响

在发酵的过程中培养液的pH 值是一项重要的发酵参数，微生物的生长和生物的合成都有其最适和能够耐受的pH 范围，因此pH 值对菌体的生长和产品的积累有很大的影响，为了达到最高的生长速率和最多的番茄红素的积累，实验选取pH 为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 5 个pH 值。选择一个合适的pH 值并使其在很窄的范围内保持稳定。结果如图7 所示。pH 从6.5 增加到7.5 时番茄红素的产量随着pH 的升高而升高，pH 从7.5 增加到8.5 时番茄红素的产量随着pH 的升高反而降低。这可能是因为霉菌有其最大的耐受pH 范围，超过这个范围后，霉菌的菌丝形态发生了改变或者引起膜的渗透性发生改变，进而影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的形成。因此选择7.5 作为实验发酵的最佳pH 值。

图7 不同发酵pH 值对番茄红素产量影响Fig.7 Effect of different fermentation pH value on the Lycopene production

2.5.2 不同发酵温度对番茄红素产量的影响

根据酶促反应的动力学，发酵的温度与酶的活性密切相关，因此选择合适的发酵温度对于番茄红素的产量有很大的影响。实验选择25、26、27、28、29 ℃温度进行发酵，结果如图8 所示。但温度从25 ℃增加到27 ℃时，番茄红素的产量随着温度的升高而升高，到27 ℃时达到最高为1.18 g·L-1，这可能是因为随着发酵温度的升高，细胞的呼吸强度增强，细胞的生长繁殖加快，致使番茄红素产量增加。27 ℃以后随着温度的增加番茄红素的产量反而下降，这可能是因为温度过高酶失活的速度加快，细胞提前加速衰老，发酵的周期缩短，致使番茄红素的产量变少。因此实验选择27 ℃作为最佳发酵温度。

图8 不同发酵温度对番茄红素产量的影响Fig.8 Effect of different fermentation temperature on the Lycopene production

图9 发酵时间对番茄红素产量的影响Fig.9 Effect of fermentation time on the Lycopene production

2.5.3 发酵时间对番茄红素产量的影响

微生物发酵时间对次级代谢产物的合成具有十分重要的影响作用，发酵时间过短，次级代谢产物合成还没有彻底完成，无法生成番茄红素。长时间的发酵会造成菌体自溶并使发酵成本过高。实验分别选择96、108、120、132、144 h 作为发酵结束时间，得出最优的发酵结束时间以积累大量的番茄红素，结果如图9 所示。可以发现在96～120 h 的时间段内，随发酵时间的延长，番茄红素的生成量逐渐增加。番茄红素的生成量在发酵进行120 h 后达到最大值1.22 g·L-1；在发酵120～144 h，番茄红素的产量反而下降，这可能是因为霉菌的发酵时间过长产生了有毒物质，造成菌体的自溶，致使番茄红素产量降低。故实验选用120 h 作为最佳发酵时间。

3 结论

实验最优的发酵条件为：碳源和氮源分别为玉米粉和黄豆粉，正负菌接种比例1∶10，发酵温度为27 ℃，发酵培养基pH 值为7.5，发酵时间为120 h、发酵后的24 h 添加发酵促进剂β-紫罗酮，发酵后的42 h 添加发酵阻断剂咪唑，此条件得到的番茄红素产量为最高。与其他方法相比较，此方法具有不受季节地理的影响、工艺简单、生产周期短、生产成本低、适于工业化生产等优点，实验找到了各因素的最佳值以获得较理想的番茄红素得率，对实际生产有指导意义，番茄红素作为功能性天然色素在医药、食品、化妆品中必将拥有广阔的应用前景和广阔的市场前景[10]，因此具有一定的发展前途。

［1］Young A J，Lowe G M.Antioxidant and proxidant properties of carotenoids［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，2001，385（1）：20-27.

［2］王强.天然胡萝卜素抑制细胞恶性转化机理的初步研究［J］.食品科学，2000，21（12）：46-47.

［3］蔡乐波.番茄红素抗癌作用的研究及进展［J］.食品研究与开发，2004，25（8）：54-55.

［4］王伟华，于国萍.番茄红素与人体健康［J］.食品研究与开发，2003，24（5）：89-92.

［5］于文利，赵亚平.番茄红素和维生素E 复合抗氧剂的抗衰老作用［J］.中国粮油学报，2003，18（1）：58-60.

［6］张丽靖，杨郁.微生物发酵生产番茄红素的研究进展［J］.生物技术通报，2006（4）：59-60.

［7］杨润蕾，张利平，王秀琴，等.番茄红素高产菌株发酵条件优化［J］.安徽农业科学，2008，36（24）：88-89.

［8］侯纯明，周鑫，庞常健，等.紫外分离测定番茄红素［J］.粮食与食品工业，2006，13（2）：12-14.

［9］王见冬，王永生，袁其朋.吡啶类化合物对三饱布拉氏霉菌代谢途径的影响［J］.现代化工，2003，1（3）：23-24.

［10］李春生.番茄红素的研究概况［J］.农产品加工：学刊，2009，1（1）：73-74.