一氧化氮对莴苣种子萌发过程中部分物质代谢的影响

杨北宁， 张凤芝， 苏国兴

(苏州大学基础医学部基础医学与生物科学学院，江苏 苏州 215123)

迄今为止，已有大量有关一氧化氮(NO)促进植物种子萌发的报道［1］。Kopyra等在羽扇豆(Lupinus luteus)中发现，一定浓度的NO供体硝普钠(SNP)可提高种子萌发率，作用效果与时间有关，48 h后SNP这种促进萌发作用消失［2］。Lamatine等报道，在26℃条件下，SNP能够明显地促进处于暗处的莴苣种子萌发，而用NO清除剂cPTIO处理则可降低对萌发的促进作用［3］。外源添加一定浓度SNP可明显提高豌豆、黄瓜、玉米和刺槐种子的发芽率［4］。Sarath等证实，NO供体SNP、亚铁氰化钾和CN－同样可促进2种温季牧草种子的萌发，并可被NO清除剂cPTIO抑制，而认定在该种子萌发过程中有NO的产生［5］。近年来，随着NO在植物种子萌发和休眠中所起作用的确定，人们相继展开了NO促进种子萌发和解除休眠的机理研究。如在拟南芥种子萌发过程中，证实NO的作用部位是糊粉层。在NO外源供体SNP诱导小麦种子萌发的研究中，发现种子的β-淀粉酶基因转录水平和β-淀粉酶活性受到SNP的促进［6］。然而，经NO和NO合成抑制剂处理后，在种子萌发过程中，种子内贮藏物质含量的变化仍鲜见报道。本研究以莴苣种子为材料，研究NO供体硝普钠(SNP)和NO生物合成抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)对莴苣种子萌发时内含物质含量和水解酶活性的影响，为NO供体促进莴苣种子萌发时物质代谢变化的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及处理

莴苣(Lactuca sativa L.)品种挂丝红种子购于四川省绵阳市种都种业有限公司。所有药品均购自Sigma公司。

莴苣种子先用0.5%的HgCl2消毒5 min，再用无菌水冲洗5次后，在22℃黑暗环境中用处理液浸种4 h，处理液浓度如下:(1)0 mmol/L(对照)、0.05 mmol/L、0.10 mmol/L、0.20 mmol/L NO 供体 SNP;(2)1.00 mmol/L NO生物合成抑制剂L-NAME，所有处理液pH 5.8。选取饱满的种子播种于含0.5%琼脂的固体培养基上，22℃暗培养。每个处理组设3个重复。

1.2 测定方法

用目测法(胚根突破种皮大于1 mm)测定0 mmol/L、0.05 mmol/L、0.10 mmol/L、0.20 mmol/L SNP处理48 h莴苣种子的萌发率及0 mmol/L、0.10 mmol/L SNP和1.00 mmol/L L-NAME分别处理12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 莴苣种子的种子萌发率。测定0 mmol/L、0.10 mmol/L SNP 和 1.00 mmol/L LNAME 分别处理12 h、24 h、36 h、48 h 莴苣种子内含物质含量和水解酶活性:粗脂肪索氏提取法测定粗脂肪含量［7］;蒽酮比色法测定可溶性糖和淀粉含量［8］;考马斯亮蓝 G250 法测定蛋白质含量［8］;3，5-二硝基水杨酸比色法测定α-淀粉酶和β-淀粉酶活性［8］;碱式滴定法测定脂肪酶活性［9］;磺胺法测定硝酸还原酶活性［10］。

1.3 统计分析

使用SPSS 11.5软件进行数据统计，用Duncan’s法比较差异显著性。应用EXCEL软件进行作图。

2 结果

2.1 不同浓度硝普钠(SNP)对莴苣种子萌发的影响

用不同浓度SNP处理莴苣种子36 h，种子的萌发率如图1所示。SNP对莴苣种子的萌发表现出显著的促进作用，在0～0.10 mmol/L浓度范围内，种子萌发率随SNP浓度的增加而升高，当SNP浓度为0.10 mmol/L时，种子萌发率最高;而当SNP的浓度增至0.20 mmol/L时，种子萌发受到明显抑制。表明0.10 mmol/L SNP促进莴苣种子萌发的效果最佳。

图1 不同浓度硝普钠对莴苣种子萌发的影响Fig.1 The effect of different concentrations of SNP on the seed germination of lettuce

2.2 0.10 mmol/L硝普钠(SNP)和1.00 mmol/L N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)对莴苣种子萌发的影响

在浸种12～36 h，0.10 mmol/L SNP处理对种子萌发的促进作用最为显著，在浸种处理24 h和36 h时，种子萌发率分别比对照增加26.5个百分点(P＜0.05)和15.5个百分点(P＜0.05)，但浸种处理48 h后这种促进作用逐渐减弱。1.00 mmol/L LNAME浸种则可显著抑制种子的萌发，在浸种36 h时，萌发率仅28.1%(图2)。

图2 0.10 mmol/L 硝普钠和 1.00 mmol/L N-硝基-L-精氨酸甲酯对莴苣种子萌发的影响Fig.2 The effect of 0.10 mmol/L SNP and 1.00 mmol/L LNAME on the seed germination of lettuce

2.3 硝普钠(SNP)和 N-硝基-L-精氨酸甲酯(LNAME)对莴苣种子萌发过程中内含物质含量的影响

如表1所示，0.10 mmol/L SNP处理下莴苣种子的粗脂肪含量和蛋白质含量均随着处理时间的延长而逐渐下降，与0 mmol/L SNP处理(对照)相比，差异均不显著(P＞0.05));0.10 mmol/L SNP处理下莴苣种子的淀粉含量随着处理时间的延长而逐渐下降，均显著低于0 mmol/L SNP处理(对照)(P＜0.05);0.10 mmol/L SNP处理下莴苣种子的可溶性糖含量随着处理时间的延长而逐渐增加，均显著高于0 mmol/L SNP处理(对照)(P＜0.05)。

表1 0.10 mmol/L SNP对莴苣种子萌发过程中内含物质含量的影响Table 1 The effects of 0.10 mmol/L SNP on some substance contents of lettuce during seed germination

如表2所示，1.00 mmol/L L-NAME处理下莴苣种子的蛋白质含量随着处理时间的延长而逐渐下降，与0 mmol/L SNP处理(对照)相比，差异均不显著(P＞0.05);1.00 mmol/L L-NAME处理下莴苣种子的粗脂肪含量随着处理时间的延长而逐渐下降，处理36 h和48 h的粗脂肪含量均显著高于0 mmol/L SNP处理(对照)(P＜0.05);1.00 mmol/L L-NAME处理下莴苣种子的淀粉含量随着处理时间的延长而逐渐下降，均显著高于0 mmol/L SNP处理(对照)(P＜0.05);0.10 mmol/L SNP处理下莴苣种子的可溶性糖含量随着处理时间的延长而逐渐增加，均显著低于0 mmol/L SNP处理(对照)(P＜0.05)。

表2 1.00 mmol/L L-NAME对莴苣种子萌发过程中内含物质含量的影响Table 2 The effects of 1.00 mmol/L L-NAME on some substance contents during lettuce seed germination

2.4 硝普钠(SNP)和 N-硝基-L-精氨酸甲酯(LNAME)处理后部分水解酶活性的变化

如图3所示，不同处理下莴苣种子萌发过程中α-淀粉酶活性均随种子处理时间的延长而逐渐增加，其中0.10 mmol/L SNP处理的α-淀粉酶活性显著高于0 mmol/L SNP处理(对照)(P＜0.05);0 mmol/L SNP处理下β-淀粉酶活性呈现先升高后降低的趋势，在处理36 h时β-淀粉酶活性均达到最高峰，0.10 mmol/L SNP处理的β-淀粉酶活性显著高于0 mmol/L SNP处理(对照)(P＜0.05);不同处理下莴苣种子萌发过程中脂肪水解酶活性均随种子处理时间的延长而逐渐增加，在浸种12～48 h 0.10 mmol/L SNP处理的种子脂肪水解酶活性均显著高于0 mmol/L SNP(对照)处理(P＜0.05);不同处理下莴苣种子萌发过程中硝酸还原酶活性均随种子处理时间的延长而逐渐增加，在浸种12～36 h 0.10 mmol/L SNP处理的种子硝酸还原酶活性均显著高于0 mmol/L SNP(对照)处理(P＜0.05)。在浸种12～36 h 1.00 mmol/L L-NAME处理的 α-淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪水解酶、硝酸还原酶的活性均显著低于0 mmol/L SNP(对照)和0.10 mmol/L SNP处理(P ＜0.05)。

图3 莴苣种子萌发过程中部分水解酶活性的变化Fig.3 The changes of some hydrolases activities during seed germination of lettuce

3 讨论

一氧化氮在植物体的多种生理过程中有重要作用。从本试验结果来看，0 mmol/L、0.05 mmol/L和0.10 mmol/L硝普钠(SNP)对莴苣种子的萌发表现出显著的促进作用，其中0.10 mmol/L硝普钠的促进作用好于其他2种处理，当SNP浓度上升到0.20 mmol/L时种子萌发受到显著抑制;在浸种12～36 h，0.10 mmol/L SNP对种子萌发的促进作用最为显著，48 h后作用消失。这与白旭等［10］关于SNP促进莴苣种子萌发的研究结果相一致。

Bethke等指出，NO促进种子的萌发可能与种子对脱落酸和赤霉素的敏感性改变有关［11］，而ABA和GA与种子水解酶的诱导合成和活性调节有关。孙永刚等在NO外源供体SNP诱导小麦种子萌发的研究中，发现种子的β-淀粉酶基因转录水平和β-淀粉酶活性受到SNP的促进［12］，这暗示在种子萌发过程中，种子内含物质的变化会受到NO的影响。在本研究中，我们发现0.10 mmol/L SNP浸种，虽可对种子蛋白质和粗脂肪含量的下降有一定的促进作用，但效果不显著;而0.10 mmol/LSNP浸种可显著降低淀粉和增加可溶性糖含量。用抑制种子萌发的NO生物合成抑制剂1.00 mmol/L L-NAME浸种，同样发现，它们对淀粉降解的抑制作用非常明显，12 h后便观察到可溶性糖含量的显著下降，而1.00 mmol/L L-NAME对种子蛋白质和粗脂肪含量的影响不大。这些结果与孙永刚等［12］的结果相符。

种子萌发过程中内含物质的变化一般与种子内水解酶活性的变化相对应。在本研究中，我们发现0.10 mmol/L SNP处理可显著增加α-淀粉酶、硝酸还原酶和脂肪水解酶活性;β-淀粉酶活性虽在处理36 h时后呈逐渐下降趋势，但前期(12～36 h)也明显受SNP促进。而用1.00 mmol/L L-NAME浸种，种子的α-淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪水解酶和硝酸还原酶活性均受到抑制。这些结果暗示，NO可能通过调节α-淀粉酶、β-淀粉酶、硝酸还原酶和脂肪酶等水解酶的活性，影响种子体内贮藏物质的降解，进而影响莴苣种子萌发，其中，对淀粉降解和可溶性糖增加的促进作用最为明显。

［1］张爱慧，朱士农.外源一氧化氮对不同贮藏年限甘蓝、黄瓜种子萌发活力的影响［J］.江苏农业科学，2012，40(3):109-111.

［2］KOPYRA M，GWOZDZ E A.Nitric oxide stimulates seed germination and counteracts the inhibitory effect of heavy metals and salinity on root growth of lupinusluteus［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2003，41:1011-1017.

［3］LAMATINA L，BELIGI M V，GARCIA M C.Method of enhancing the metabolic function and the growing conditions of plants and seeds［J］.United State Patent，2001，6:242-384.

［4］周永斌，殷 有，苏宝玲，等.外源一氧化氮供体对几种植物种子的萌发和幼苗生长的影响［J］.植物生理学通讯，2005，46(3):21-27.

［5］SARATH G，BETHKE P C，JONES R，et al.Nitric oxide accelerates seed germination in warm-season grasses ［J］.Planta，2006，223:1154-1164.

［6］赵福庚，刘友良.高等植物体内特殊形态多胺的代谢及调节［J］.植物生理学通讯，2000，36(1):1-6

［7］张志良.植物生理学实验指导［M］.2版.北京:人民教育出版社，1990.

［8］李合生.植物生理生化实验原理和技术［M］.北京:高等教育出版社，2000.

［9］黄学林，陈润政.种子生理试验手册［M］.北京:中国农业出版社，1998.

［10］白 旭，苏国兴，孙 娜，等.外源多胺对莴苣种子萌发诱导效应及其与一氧化氮的关系［J］.西北植物学报，2009，29(9):1860-1866.

［11］BETHKE P C，LIBOURELI G L，AOYAMA N，et al.The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide，gibberellin，and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy［J］.Plant Physiology，2007，143:1173-1188.

［12］孙永刚，凌腾芳，王家杰，等.外源一氧化氮供体硝普钠对小麦种子萌发早期淀粉酶及其亚细胞分布的影响［J］.作物学报，2008，34(9):1608-1614.