乳腺癌细胞雌激素受体非配体依赖性激活对来曲唑耐药的机制研究

陈洪岩，刘芝华

·基础研究·

乳腺癌细胞雌激素受体非配体依赖性激活对来曲唑耐药的机制研究

陈洪岩，刘芝华

目的研究雌激素受体(ER)转录调节变化在乳腺癌细胞对来曲唑耐药中的作用及其机制。方法以来曲唑耐药细胞(MCF-7-LR-1、MCF-7-LR-2)和对照细胞(MCF-7-Aro、MCF-7-T)为研究对象。通过Western blotting检测ER和磷酸化ER[pER(Ser118)]在两组细胞中的表达水平。通过染色质免疫共沉淀(ChIP)方法检测雌二醇(E2)处理前后细胞中ER与X盒结合蛋白1(XBP-1)增强子和三叶因子1(TFF-1)启动子区的结合情况。通过Real-time qRT-PCR比较XBP-1和TFF-1 mRNA的表达，以及雌激素反应性基因CA2、GJA1、PGR、CTSD mRNA的表达。结果与对照细胞相比，来曲唑耐药细胞中pER(Ser118)水平显著增加，但ER表达水平并无明显变化。ChIP结果表明，与对照细胞相比，MCF-7-LR-2细胞中ER在非配体激活条件下(未加E2处理)及配体激活条件下(10nmol/L E2处理45min)与XBP-1增强子区及TFF-1启动子区的结合均显著增加。qRT-PCR结果表明，与未经E2处理的MCF-7-Aro细胞相比，耐药细胞中XBP-1和TFF-1表达均显著增加；与MCF-7-T细胞相比，耐药细胞中CA2和GJA1表达增高，PGR和CTSD的表达降低。结论在来曲唑耐药的乳腺癌细胞中，ER以配体非依赖方式激活，pER(Ser118)水平增加，从而促进相关靶基因的转录，该机制在乳腺癌细胞对来曲唑耐药的过程中发挥重要作用。

乳腺肿瘤；受体，雌激素；抗药性，肿瘤；X盒结合蛋白质1；三叶因子1

乳腺癌是一种伴随特定的形态学/组织学改变、遗传学/表观遗传学改变和基因表达产物障碍的疾病[1]，严重危害女性的身心健康。雌激素受体(ER)信号通路在调控乳腺细胞增殖和凋亡等生理功能中发挥着重要作用。ER信号通路失调可导致相关基因表达失衡或改变胞质内的蛋白功能，促使乳腺细胞过度增殖或凋亡受阻，从而导致乳腺癌发生，另一方面还可促使乳腺癌由雌激素依赖型向雌激素非依赖型转化，造成治疗抵抗[2]。选择性雌激素受体调节剂(他莫昔芬，tamoxifen)和芳香化酶抑制剂是ER阳性乳腺癌患者的主要治疗药物。他莫昔芬在乳腺癌临床治疗中取得了令人瞩目的疗效，但会增加妇女发生血栓栓塞和子宫内膜癌的概率，且患者对药物耐药会导致癌症复发[3-5]。与他莫昔芬相比，抑制雄激素转换成雌激素的芳香化酶抑制剂具有更好的疗效和耐受性，能有效延长患者生存期[6-8]。非甾体类第三代芳香化酶抑制剂来曲唑(letrozole)作为绝经后乳腺癌患者的一线临床用药，具有很好的临床疗效和耐受性，但长期应用后仍会发生药物抵抗[9-10]。

已有研究表明，ER磷酸化水平增加能促进相关靶基因的转录，从而在他莫昔芬耐药中发挥重要作用[11]。其中，ER经典的靶基因X盒结合蛋白1 (XBP-1)和三叶因子1(TFF-1)备受关注[12]。体外研究表明，XBP-1与他莫昔芬耐药密切相关，临床研究进一步显示XBP-1高表达与接受他莫昔芬治疗的乳腺癌患者的不良预后相关[2]。同时，ER非配体依赖性的激活可增强TFF-1的转录，从而促进乳腺癌细胞非激素依赖性增殖，在乳腺癌内分泌治疗抵抗中发挥着重要作用[13]。鉴于ER在乳腺癌发生发展和他莫昔芬抵抗中的重要作用，我们推测其在来曲唑耐药中可能具有同等作用。本实验采用人乳腺癌细胞株MCF-7[14]研究来曲唑耐药细胞中ER非配体依赖性激活对靶基因XBP-1和TFF-1转录调节的影响，探讨ER在乳腺癌细胞来曲唑耐药过程中的作用机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂 睾酮、β-雌二醇(β-estradiol)、来曲唑购自美国Sigma公司；RNA提取试剂盒(RNeasy Plus Mini Kit)购自美国Qiagen公司；反转录试剂盒(high-capacity cDNA reverse transcription kits)和实时定量PCR试剂(SYBR Green PCR Master Mix)购自美国ABI公司；BCA蛋白定量试剂盒、化学发光试剂(ECL)购自美国Pierce公司；蛋白酶抑制剂(PI)购自德国Roche公司；G418购自美国Invitrogen公司；pER (Ser118) 和Calnexin抗体购自美国Cell Signaling公司；ER抗体购自美国Santa Cruz公司；过氧化物酶标记的二抗购自美国Sigma公司。

1.2耐药细胞和对照细胞的建立 来曲唑耐药的乳腺癌细胞(MCF-7-LR-1、MCF-7-LR-2)及其对照细胞(MCF-7-Aro、MCF-7-T)由本实验室建立，细胞株的建立方式如下。MCF-7-Aro细胞：课题组前期研究建立的过表达芳香化酶的细胞株[15]。MCF-7-T细胞：为对照细胞，将MCF-7-Aro细胞培养在加入睾酮和来曲唑溶剂对照(DMSO)的去激素培养基中。MCF-7-LR-1和MCF-7-LR-2细胞：在100nmol/L和200nmol/L来曲唑作用下筛选获得的耐药细胞。耐药细胞筛选步骤：将MCF-7-Aro培养于含有睾酮和芳香化酶抑制剂来曲唑的去激素培养基，尽管有睾酮存在，但来曲唑可抑制芳香化酶将睾酮转换为雌激素，所以在筛选过程中大部分细胞死亡，经过3个月的筛选，最终获得耐药细胞。

细胞培养：MCF-Aro细胞培养于含10%胎牛血清、丙酮酸钠、100U/ml青霉素、100U/ml 链霉素、400μg/ml G418的DMEM培养基中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。将MCF-7-LR细胞培养于含有睾酮和来曲唑的去激素培养基[去除酚红，含10%活性炭吸附的胎牛血清(CFBS)、丙酮酸钠、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养基]。MCF-7-T细胞培养在加入睾酮和DMSO的去激素培养基中。

1.3Western blotting检测 取来曲唑耐药细胞(MCF-7-LR-1、MCF-7-LR-2)及对照细胞(MCF-7-Aro、MCF-7-T)，在去激素培养基中培养3d，收集细胞，离心获得细胞沉淀，加入含1×PI的RIPA裂解液(1×DPBS，1% Nonidet P-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS)进行裂解，冰上放置20min，13 000×g离心收集上清。采用BCA法行蛋白定量，取20μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转至PVDF膜，封闭、一抗孵育、洗膜，用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育、洗膜，采用化学发光ECL系统检测ER的表达和磷酸化(pER，Ser118)水平，以钙联蛋白(calnexin)作为上样对照。

1.4染色质免疫共沉淀(ChIP)检测 为验证ER磷酸化水平增加对靶基因调节区域结合能力的影响，采用ChIP法检测耐药细胞及对照细胞中ER与XBP-1和TFF-1调节区域的结合情况，其中E2溶于乙醇，同时以乙醇处理细胞作为溶剂对照。根据文献[16]选择XBP-1第2个增强子区(XBP-1 ENH2)和TFF-1启动子区(TFF-1 Pro)用于判断ER对靶基因调节区域的结合情况，以XBP-1启动子区(XBP-1 Pro)为无ER结合的阴性对照区。取MCF-7-Aro、MCF-7-T、MCF-7-LR-1和MCF-7-LR-2细胞，接种至去激素培养基，培养3d，至细胞融合约达90%，用10nmol/L E2处理45min，以1%甲醛于37℃固定细胞10min，预冷PBS洗涤细胞2次，加入1ml预冷PBS，用细胞刮收集细胞，3 000×g离心5min，收集细胞沉淀，加入300μl含PI的细胞裂解液[1% SDS，5mmol/L EDTA，50mmol/L Tris-HCl (pH8.1)]在冰上裂解10min。经Bioruptor超声破碎仪破碎细胞(使DNA片段集中在300～500bp)，4℃、14 000×g离心10min收集上清。取20μl作为Input对照，用Dilution buffer[1% Triton X-100，2mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl(pH8.1)1×PI]按照1:10稀释。加入鲑精DNA、预清除免疫球蛋白(IgG)和45μl Protein A-sepharose 在4℃预清除2h。收集上清液加入ER抗体，4℃过夜孵育，第2天加入45μl protein A-sepharose 4℃孵育1h，收集Beads，依次用TSE Ⅰ、TSE Ⅱ、Buffer Ⅲ和TE缓冲液洗涤，每次10min。此后用100μl Elution buffer (1% SDS，0.1mol/L NaHCO3)室温10min洗脱DNA。经65℃孵育6h，解交联后用PCR纯化试剂盒(Qiagen公司)进行DNA纯化，然后用下述引物进行Real-time PCR分析。结果以相对于Input的百分比进行计算，公式为

ChIP引物序列(3'-5')如下。XBP-1：正义TCTG GAAAGCTCTCGGTTTG，反义AATCCCTGGCCAA AGGTACT；XBP-1 Enh2：正义TTGCTGTGCAAAC AATAGCC，反义GTCCAAGGGCACATTCTCAT；TFF-1：正义CACCCCGTGAGCCACTGT，反义CTGCAGAAGTGATTCATAGTGAGAGAT。

1.5Real-time qRT-PCR检测 取MCF-7-Aro细胞，在去激素培养基中培养3d，加入E2处理12h后收集细胞(称为MCF-7-Aro-E2)。取MCF-7-Aro、MCF-7-Aro-E2、MCF-7-T和MCF-7-LR-2细胞，提取RNA并反转录成cDNA，用XBP-1、TFF-1和β-actin特异性引物进行Real-time PCR检测，结果以相对于β-actin的表达量表示。

根据文献[17]、[18]选择芳香化酶抑制剂及他莫昔芬耐药细胞中表达改变的雌激素反应性基因碳酸酐酶2(CA2)、缝隙连接α-1蛋白(GJA1)、孕激素受体(PGR)和组织蛋白酶D(CTSD)，通过Real-time qRT-PCR检测上述基因在 MCF-7-T和MCF-7-LR-2细胞中的表达情况。以MCF-7-T和MCF-7-LR-2细胞的cDNA作为模板，用CA2、GJA1、PGR和CTSD特异性引物行Real-time qRT-PCR检测，结果以相对于β-actin的表达量表示。

采用RNeasy Plus Mini Kit提取试剂盒提取RNA，去除DNA，使用Nanodrop分光光度计行RNA定量，取1μg RNA，用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits反转录试剂盒行cDNA合成。使用SYBR Green PCR Master Mix试剂，以XBP-1、TFF-1和β-actin 特异性引物行Real-time PCR。同时检测MCF-7-T和MCF-7-LR-2细胞中CA2、GJA1、PGR和CTSD的mRNA表达水平。特异基因的mRNA相对表达量采用如下公式进行计算：2(40－Ct-target)/2(40－Ct-β-actin)。

引物由上海英骏工程公司合成，序列(3'-5')如下。XBP-1：正义GCGCCTCACGCACCTG，反义GCTGCTACTCTGTTTTTCAGTTTCC；TFF-1：正义GTGTCACGCCCTCCCAGT，反义GGACCCCACG AACGGTG；CTSD：正义AGCTCCTGGACCAGAAC ATCT，反义GGGTGACATTCAGGTAGGACA；PGR：正义AGGTCTACCCGCCCTATCTC，反义CAGCTCCCACAGGTAAGGAC；GJA1:正义ATAGACAGGTCTGAGTGCCTGAA，反义CAGTTGAGTAGGCTTGAACCTTG；CA2:正义CCTCCTCTTCTGGAATGTGTG，反义CCAGTTGTCCACCATCAGTTC；β-actin:正义GGCGGCACCACCATGTACCCT，反义AGGGGCCGGACTCGTCATACT。

1.6统计学处理 采用 SPSS 19.0软件进行统计分析。数据结果以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析法，进一步两两比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

图1 来曲唑耐药细胞及对照细胞中ER表达和磷酸化(pER，Ser118)水平检测(Western blotting)Fig. 1 Expression of ER and phosphorylation of ER at Ser-118 in letrozole resistant cells and control cells (Western blotting)

2.1Western blotting 检测结果 由图1可见，与去激素条件下培养的MCF-7-Aro和MCF-7-T细胞相比，MCF-7-LR-1和MCF-7-LR-2细胞中ER磷酸化(pER，Ser118)水平显著增加，但ER总体表达水平无显著变化，表明来曲唑耐药细胞中ER以配体非依赖的方式激活。

图2 来曲唑耐药细胞及对照细胞中ER在靶基因XBP-1和TFF-1调节区域的结合(ChIP检测)Fig.2 Conjugation of ER on the regulatory regions of target genes in Letrozole resistant and control cells(Chromatin Immunoprecipitation)

2.2ChIP检测结果 由图2A可见，除MCF-7-LR-1中ER在TFF-1 Pro处的结合未被显著诱导外，E2处理可显著诱导各组细胞中ER在XBP-1 ENH2处和TFF-1Pro处的结合，但在XBP-1 Pro处的结合无明显改变。由图2B可见：无E2处理条件下，与对照细胞(MCF-7-Aro和MCF-7-T)比较，来曲唑耐药细胞(MCF-7-LR-1和MCF-7-LR-2)中ER在XBP-1 ENH2处和TFF-1 Pro处的结合显著增强。在E2处理条件下，与对照细胞MCF-7-Aro比较，100nmol/L来曲唑筛选获得的耐药细胞MCF-7-LR-1中ER在XBP-1 ENH2处的结合显著增加，而在TFF-1 Pro处的结合并无显著变化；与对照细胞MCF-7-T比较，MCF-7-LR-1细胞中ER在XBP-1 ENH2处和TFF-1 Pro区的结合均无明显变化；与对照细胞(MCF-7-Aro和MCF-7-T)比较，200nmol/L来曲唑筛选获得的耐药细胞MCF-7-LR-2中ER在XBP-1 ENH2和TFF-1 Pro处的结合均进一步增强。该结果表明来曲唑耐药细胞中ER以配体非依赖的方式激活，从而促进其与靶基因XBP-1和TFF-1调节区域的结合。

2.3Real-time qRT-PCR检测结果 由图3A可见，与去激素条件下培养的MCF-7-Aro细胞相比，经E2处理获得的MCF-7-Aro-E2细胞中XBP-1和TFF-1 mRNA水平显著增加；MCF-7-T细胞中，因芳香化酶将雄激素转换成雌激素，所以XBP-1和TFF-1的表达维持在较高水平；而MCF-7-LR-2细胞中XBP-1和TFF-1的表达均显著增加。

由图3B可见，与MCF-7-T细胞相比，MCF-7-LR-2细胞中CA2和GJA1表达上调，而PGR和CTSD表达下调，表明来曲唑耐药细胞中激素反应性基因CA2和GJA1选择性表达增加，而激素反应性基因PGR和CTSD依然保持对来曲唑的敏感性。

3 讨 论

图3 来曲唑耐药细胞及对照细胞中雌激素反应性基因(ERGs)表达(qRT-PCR检测)Fig. 3 Expression of estrogen responsive genes(ERGs) in letrozole resistant cells and the control cells (quantitative reverse transcription PCR)

大约2/3的乳腺癌患者ER表达阳性。ER既是乳腺癌内分泌治疗的重要靶点，也是判断治疗反应的重要生物标志分子[19-20]。ER与配体E2结合后，与热休克蛋白HSP90解离，促进ER结合在雌激素反应元件(ERE)上，调控靶基因转录，从而调节细胞增殖[21]。在缺乏雌激素的情况下，生长因子激活的细胞内信号途径诱导ER与ERE结合以调节基因的转录。表皮生长因子(EGF)通过EGF受体→Ras→Raf→MAPKKK→MAPKK→MAPK磷酸级联反应，使ER的Ser118磷酸化，导致ER激活[22]。应用ER选择性调节剂(如他莫昔芬)和芳香化酶抑制剂是ER阳性乳腺癌患者内分泌治疗的主要策略，而ER信号通路异常改变可促使乳腺癌细胞由激素依赖型向激素非依赖型转变，导致耐药或内分泌治疗失败[2]。研究表明，他莫昔芬耐药细胞中ER磷酸化水平增加，并且在激素非依赖的MCF-7-LETD细胞(长期培养在去激素培养基中筛选获得的不再依赖雌激素增殖的MCF-7细胞)中ER磷酸化(pER，Ser118)水平也显著增加[22-23]。本研究检测来曲唑耐药细胞中ER的表达和磷酸化水平，结果也显示ER磷酸化水平增加，表明在来曲唑耐药细胞中ER以配体非依赖的方式激活。ER磷酸化水平增加可增强ER共激活因子SRC3的结合并提高其对雌激素的敏感性，由此改变对靶基因的转录调节[22,24]。研究表明，ER磷酸化水平增高导致靶基因转录调节改变与他莫昔芬耐药密切相关，并且ER在全基因组结合位点的改变与乳腺癌的临床预后密切相关[25-26]。为了解ER磷酸化水平增加是否可以改变ER与靶基因调节区域的结合，本研究应用ChIP法检测E2处理前后ER在靶基因调节区域结合能力的改变。结果发现，来曲唑耐药细胞中ER以配体非依赖的方式结合在其靶基因的调节区域，并且在200nmol/L来曲唑筛选获得的耐药细胞(MCF-7-LR-2)中E2处理可进一步增强ER的结合能力，而100nmol/L来曲唑筛选获得的耐药细胞(MCF-7-LR-1)中E2处理并不能进一步增强ER在TFF-1 Pro的结合能力，该结果可能是由于两个浓度筛选获得的耐药细胞对来曲唑抵抗程度不同造成的。因此，我们选择MCF-7-LR-2继续此后的研究。有研究显示ER的异常磷酸化可导致其在全基因组结合位点的改变，影响靶基因的转录，从而在他莫昔芬耐药中发挥重要作用[27-29]。为此，本研究进一步检测了来曲唑耐药细胞中XBP-1和TFF-1转录水平的改变，结果发现来曲唑耐药细胞中TFF-1和XBP-1的转录水平显著高于MCF-7-Aro细胞，表明来曲唑耐药细胞中ER激活促进了其在靶基因调节区域的结合以及靶基因的转录。由于芳香化酶的功能是将雄激素转换成雌激素，从而影响雌激素反应性基因的表达，而芳香化酶抑制剂可通过抑制芳香化酶的功能从而拮抗雌激素反应性基因表达[30]。为了进一步研究耐药细胞中雌激素反应性基因的表达改变，我们根据文献[17]、[18]选择芳香化酶抑制剂耐药细胞中表达上调的基因CA2和GJA1，以及他莫昔芬耐药细胞中表达下调的激素反应性基因PGR和CTSD进行检测，结果发现来曲唑耐药细胞中CA2和GJA1表达显著上调，而PGR和CTSD表达下调，表明来曲唑耐药细胞中雌激素反应性基因的改变与芳香化酶抑制剂耐药及他莫昔芬耐药的细胞有一定相似性，进一步证实了来曲唑耐药细胞中ER对靶基因的转录调节过程紊乱。后续研究需进一步阐明来曲唑耐药细胞中ER转录调节过程紊乱的特征，以鉴定介导来曲唑耐药的关键性功能分子，为寻找有效的治疗靶点提供依据。

综上，来曲唑耐药细胞中ER对靶基因的转录调节发生了选择性改变，在后续研究中，我们拟通过染色质免疫共沉淀结合高通量测序方法(ChIP-Seq)鉴定来曲唑耐药细胞中ER在全基因组中结合位点的改变，并通过基于测序技术的转录组学方法(RNASeq)检测、筛选表达改变的基因，结合ChIP-Seq和RNA-Seq的结果分析ER转录调节过程改变的特征，并鉴定来曲唑耐药细胞中ER的功能性靶基因。

[1]Polyak K. Breast cancer: origins and evolution[J]. J Clin Invest, 2007, 117(11): 3155-3163.

[2]Musgrove EA, Sutherland RL. Biological determinants of endocrine resistance in breast cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2009, 9(9): 631-643.

[3]Jordan VC. Tamoxifen (ICI46,474) as a targeted therapy to treat and prevent breast cancer[J]. Br J Pharmacol, 2006, 147(Suppl 1): S269-S276.

[4]Osborne CK, Shou J, Massarweh S, et al. Crosstalk between estrogen receptor and growth factor receptor pathways as a causefor endocrine therapy resistance in breast cancer[J]. Clin Cancer Res, 2005, 11(2 Pt2): 865s-870s.

[5]Ring A, Dowsett M. Mechanisms of tamoxifen resistance[J]. Endocr Relat Cancer, 2004, 11(4): 643-658.

[6]Coombes RC, Hall E, Gibson LJ, et al. A randomized trial of exemestane after two to three years of tamoxifen therapy in postmenopausal women with primary breast cancer[J]. N Engl J Med, 2004, 350(11): 1081-1092.

[7]Goss PE, Ingle JN, Martino S, et al. Randomized trial of Letrozole following tamoxifen as extended adjuvant therapy in receptor-positive breast cancer: updated findings from NCIC CTG MA.17[J]. J Natl Cancer Inst, 2005, 97(17): 1262-1271.

[8]Howell A, Cuzick J, Baum M, et al. Results of the ATAC (Arimidex, Tamoxifen, Alone or in Combination) trial after completion of 5 years' adjuvant treatment for breast cancer[J]. Lancet, 2005, 365(9453): 60-62.

[9]Chumsri S, Howes T, Bao T, et al. Aromatase, aromatase inhibitors, and breast cancer[J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 2011, 125(1-2): 13-22.

[10]Guo ZH, Yang KH, Tian JH, et al. Systemic evaluation of the curative effect of letrozole for terminal breast cancer in postmenopausal patients[J]. Med J Chin PLA, 2010, 35(9): 1132-1136. [郭智慧, 杨克虎, 田金徽, 等. 不同剂量来曲唑治疗绝经后晚期乳腺癌疗效的系统评价[J]. 解放军医学杂志, 2010, 35(9): 1132-1136.]

[11]Vendrell JA, Bieche I, Desmetz C, et al. Molecular changes associated with the agonist activity of hydroxy-tamoxifen and the hyper-response to estradiol in hydroxy-tamoxifen-resistant breast cancer cell lines[J]. Endocr Relat Cancer, 2005, 12(1): 75-92.

[12]Carroll JS, Brown M. Estrogen receptor target gene: an evolving concept[J]. Mol Endocrinol, 2006, 20(8): 1707-1714.

[13]Kuske B, Naughton C, Moore K, et al. Endocrine therapy resistance can be associated with high estrogen receptor alpha (ERalpha) expression and reduced ERalpha phosphorylation in breast cancer models[J]. Endocr Relat Cancer, 2006, 13(4): 1121-1133.

[14]Xie HP, Yan JT, Tang L, et al. Deletion breakpoint mapping on chromosome 9p21 in breast cancer cell line MCF-7[J]. Med J Chin PLA, 2012, 37(5): 405-408. [谢华平, 严江涛, 汤琳, 等.乳腺癌MCF-7细胞系9p21缺失断点的精确定位分析[J]. 解放军医学杂志, 2012, 37(5): 405-408.]

[15]Chen HY, Liu ZH. The generation of aromatase inhibitor (Letrozole)-resistant breast cancer (LRBC) cell model[J]. Chin J Oncol, 2013, 35(6): 423-428. [陈洪岩, 刘芝华. 芳香化酶抑制剂来曲唑(Letrozole)耐药的乳腺癌细胞模型的建立[J].中华肿瘤杂志, 2013, 35(6): 423-428.]

[16]Carroll JS, Liu XS, Brodsky AS, et al. Chromosome-wide mapping of estrogen receptor binding reveals long-range regulation requiring the forkhead protein FoxA1[J]. Cell, 2005, 122(1): 33-43.

[17]Masri S, Phung S, Wang X, et al. Molecular characterization of aromatase inhibitor-resistant, tamoxifen-resistant and LTEDaro cell lines[J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 2010, 118(4-5): 277-282.

[18]Zhou C, Zhong Q, Rhodes LV, et al. Proteomic analysis of acquired tamoxifen resistance in MCF-7 cells reveals expression signatures associated with enhanced migration[J]. Breast Cancer Res, 2012, 14(2): R45.

[19]Sorlie T, Perou CM, Tibshirani R, et al. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, 98(19): 10869-10874.

[20]Sorlie T, Tibshirani R, Parker J, et al. Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100(14): 8418-8423.

[21]Huang J, Li X, Yi P, et al. Targeting estrogen responsive elements (EREs): design of potent transactivators for ERE-containing genes[J]. Mol Cell Endocrinol, 2004, 218(1-2): 65-78.

[22]Osborne CK, Schiff R. Growth factor receptor cross-talk with estrogen receptor as a mechanism for tamoxifen resistance in breast cancer[J]. Breast, 2003, 12(6): 362-367.

[23]Martin LA, Farmer I, Johnston SR, et al. Enhanced estrogen receptor (ER) alpha, ERBB2, and MAPK signal transduction pathways operate during the adaptation of MCF-7 cells to long term estrogen deprivation[J]. J Biol Chem, 2003, 278(33): 30458-30468.

[24]Likhite VS, Stossi F, Kim K, et al. Kinase-specific phosphorylation of the estrogen receptor changes receptor interactions with ligand, deoxyribonucleic acid, and coregulators associated with alterations in estrogen and tamoxifen activity[J]. Mol Endocrinol, 2006, 20(12): 3120-3132.

[25]Hurtado A, Holmes KA, Ross-Innes CS, et al. FOXA1 is a key determinant of estrogen receptor function and endocrine response[J]. Nat Genet, 2011, 43(1): 27-33.

[26]Ross-Innes CS, Stark R, Teschendorff AE, et al. Differential oestrogen receptor binding is associated with clinical outcome in breast cancer[J]. Nature, 2012, 481(7381): 389-393.

[27]Zwart W, Griekspoor A, Rondaij M, et al. Classification of antiestrogens according to intramolecular FRET effects on phosphomutants of estrogen receptor alpha[J]. Mol Cancer Ther, 2007, 6(5): 1526-1533.

[28]Britton DJ, Hutcheson IR, Knowlden JM, et al. Bidirectional cross talk between ERalpha and EGFR signalling pathways regulates tamoxifen-resistant growth[J]. Breast Cancer Res Treat, 2006, 96(2): 131-146.

[29]Lupien M, Meyer CA, Bailey ST, et al. Growth factor stimulation induces a distinct ER(alpha) cistrome underlying breast cancer endocrine resistance[J]. Genes Dev, 2010, 24(19): 2219-2227.

[30]Itoh T, Karlsberg K, Kijima I, et al. Letrozole-, anastrozole-, and tamoxifen-responsive genes in MCF-7aro cells: a microarray approach[J]. Mol Cancer Res, 2005, 3(4): 203-218.

The mechanism of ligand-independent activation of estrogen receptor in letrozole-resistant breast cancer cells

CHEN Hong-yan, LIU Zhi-hua*
State Key Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Institute and Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100021, China
*

, E-mail: liuzh@cicams.ac.cn
This work was supported by PUMC Youth Fund and the Fundamental Research Funds for the Central Universities (2012D19)

ObjectiveTo investigate the functions and mechanisms of transcriptional regulation changes in estrogen receptor (ER) on letrozole resistance in breast cancer cells.MethodsLetrozole resistant cells (MCF-7-LR-1 and MCF-7-LR-2) and control cells (MCF-7-Aro and MCF-7-T) were used in present study. The levels of ER phosphorylation at Ser-118 and expressions of ER in these two groups were determined by Western blotting. The conjugation of ER with XBP-1 enhancer and TFF-1 promoter with or without β-Estradiol (E2) was detected by Chromatin Immuno-coprecipitation (ChIP) assay. The mRNA expression levels of XBP-1 and TFF-1 were determined by quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) analysis. Furthermore, the mRNA expressions of estrogen responsive genes (ERGs) including CA2, GJA1, PGR, and CTSD were assayed also by qRTPCR analysis.ResultsThe level of ER phosphorylation at Ser-118 significantly increased in MCF-7-LR cells than in control cells. However, the ER expression showed no significant change. ChIP assay demonstrated that, under ligand-independent (without E2 treatment) or ligand-dependent (with E2 treatment 10nmol/L E2 treatment for 45min) condition, the conjugation of ER with XBP-1 enhancer and TFF-1 promoter significantly increased in MCF-7-LR-2 cells than in control cells. qRT-PCR analysis showed that the mRNA expressions of XBP-1 and TFF-1 increased in MCF-7-LR-2 cells compared with those in MCF-7-Aro cells without E2 treatment. Furthermore, the mRNA expressions of CA2 and GJA1 increased, whereas the mRNA expressions of PGR and CTSD decreased in MCF-7-LR-2 cells versus MCF-7-T cells.ConclusionThe level of ER phosphorylation at Ser-118 increased in aligand-independent manner, thereby promoting the transcription of target genes in letrozole resistant breast cancer cells, and it plays an important role in letrozole resistance.

breast neoplasms; receptors, estrogen; drug resistance, neoplasm; X-box-protein 1; trefoil factor 1

R736.8

A

0577-7402(2013)06-0461-06

2013-03-23；

2013-04-14)

(责任编辑：沈宁)

协和青年基金；中央高校基本科研业务费专项资金(2012D19)

陈洪岩，医学博士，助理研究员。主要从事肿瘤发生发展的分子机制研究

100021 北京 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室(陈洪岩、刘芝华)

刘芝华，E-mail：liuzh@cicams.ac.cn