响应面优化超声酶法提取石榴花中黄酮类物质

史晓华

（山东职业学院生物工程学院，山东济南 250104）

黄酮类物质对人体的九大系统有显著影响，能够直接影响内分泌系统和免疫系统，其原因是它是小分子量化合物，且能够顺利通过人体的保护系统，对机体产生相应的影响。随着对该类物质研究的深入，我们发现人类必需的微量营养素可能包括部分该类物质。拥有着两千多年栽培记录的石榴是小乔木的一种，它不仅具有观赏价值，而且文化底蕴丰厚，最重要的是石榴身上每一个地方都是宝，尤其是石榴花，加之我国每年有超过38 万多吨的石榴产量[1-4]，因而对其研究将成为一个充满前景且富有挑战的课题。本文重点对石榴花中黄酮类物质的提取进行初探，寻求一种最佳提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

石榴花、芦丁、香草醛、铁氰化钾、硅胶G、羧甲基纤维素钠；纤维素酶：购于Novozymes；其他试剂均为分析纯。

1.2 设备

BARTORIUS AG 电子天平：上海精密科学仪器有限公司；JA1003 电子天平：上海奥阳衡器有限公司；MYDK-98-ⅡA（单列两孔）恒温水浴锅：上海摩亿仪器设备有限公司；电热恒温干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；电炉；超声波破碎仪：南京舜玛仪器设备有限公司；台式低速离心机：上海摩亿仪器设备有限公司；UV-7501 紫外可见分光光度计：北京中西化玻仪器有限公司；90-2 恒温定时磁力搅拌器：上海精科仪器设备有限公司。

1.3 方法[5-11]

制作工艺：干石榴花→分选→干燥→粉碎→确定最佳工艺参数试验→酶合超声提取→响应面法优化工艺参数→薄层层析分离→紫外分光光度法测含量→计算提取率

1.4 操作要点

1.4.1 石榴花粉的制备

取优选出的石榴花置于干燥箱中，干燥约4 h，然后将其在研钵中迅速研磨成粉，置于干燥的环境中，备用。

1.4.2 酶解

分别将用电子天平精确称取的石榴花粉1.00 g、一定量的纤维素酶和10 mL 蒸馏水加入100 mL 烧杯中，混匀后将烧杯放入水浴锅酶解一段时间。通过单因素实验确定纤维素酶的最佳添加量和最佳T酶解。

1.4.3 纤维素酶高温灭活

取300 mL 左右的自来水加入1 000 mL 的大烧杯中，放在电炉子上加热5 min，将水浴后的烧杯连同溶液一起放入大烧杯中，继续加热至大烧杯中的水沸腾，确保纤维素酶灭活完全。

1.4.4 超声波处理

将装有样品的烧杯冷却至室温后，加入80%的乙醇溶液10 mL，摇匀，进行超声波处理。该实验中将超声波处理时间作为单因素进行考察。详细操作见结果与讨论。

1.4.5 离心

将离心机的转速设置为1.1×104r/min，离心25 min，然后将倾出上清液，放入冰箱备用。

1.4.6 黄酮类物质提取率η 的测定

提取后用体积比为1.7 ∶3.8 ∶7.9 ∶5.9 的甲酸、甲醇、乙酸乙酯、氯仿展开剂进行层析分离，然后利用紫外-可见分光光度法根据其吸光度换算含量，计算出黄酮类物质的质量（m）。

式中：M 为样品液黄酮类物质的质量，mg；η 为石榴花中黄酮类物质提取率，%；M 为石榴花干重，mg。

2 结果与分析

2.1 确定最佳工艺参数

2.1.1 酶添加量的确定

称取干石榴花粉末1.00 g，T酶解为60 min，T超声20 min，改变酶的添加量，实验结果见图1。

图1 M酶添加量对黄酮类物质提取率的影响Fig.1 The impact on adding amount of enzymes of extraction rate of flavonoids

由图1 可以看出，在适当范围内，黄酮类物质提取率会随着酶添加量的增加而增加。酶用量的增加可以使细胞壁破坏的更快，加快黄酮类物质的传递；但是酶用量足以破坏所有的细胞壁时，酶的增加将不会提高提取率；同时由于纤维素酶作用提高糖浓度反而使黄酮类物质提取难度加大，一定程度降低提取率。从图中可以看出，该物质的提取率达到最高时，所用的酶量为0.05 g，所以，酶添加量为0.04 g～0.06 g 时，为酶合超声提取实验的最佳酶添加量取值范围。

2.1.2 酶解时间的确定

称取干石榴花粉末1.00 g，M酶添加量为0.05 g，T超声20 min，改变T酶解，实验结果见图2。

图2 T酶解对黄酮类物质提取率的影响Fig.2 The impact on enzymatic time of extraction rate of flavonoids

由图2 可以看出，随T酶解的延长，更多的酶与细胞壁作用，提取率逐渐升高；当所有的酶都已经发挥作用时，T酶解的延长不仅不会提高提取率，反而黄酮类物质被分解而降低提取率。当提取率达到最高43.70%时，T酶解为60 min，所以，在本实验中T 酶解为50 min～70 min 时，是最佳取值范围。

2.1.3 超声时间的确定

称取干石榴花粉末1.00 g，M酶的添加量为0.05 g，T酶解为60 min，改变T超声，实验现象如下图3 所示。

图3 T超声对黄酮类物质提取率的影响Fig.3 The impact on ultrasonic time of extraction rate of flavonoids

由图3 可以看出，在一定范围内提取率随T超声的延长而提高，此时超声波会更多的破坏细胞壁而加快黄酮类物质的传质；当超声波足以破坏所有的细胞壁时，保护层受到破坏进而使黄酮类物质遭到破坏，从而降低黄酮类物质的量。T超声在20 min 时，石榴花中的黄酮类物质的提取率最高为44.90%，酶合超声提取的最佳T超声范围为15 min～25 min。

2.2 响应面试验[12]

本试验的水平因素表见下表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal experiment level of form factors

根据已经得出的最佳范围，采用mintab 15 软件进行响应面优化。选取M酶添加量、T酶解和T超声为三个单因素对干石榴花中黄酮类物质提取率进行优化，以期获得最佳的提取工艺。

表2 响应面实验设计及实验结果Table 2 Response surface experimental design and experimental results

表3 回归模型的方差分析Table 3 The analysis of varianceof regression model

2.3 回归模型的检验

在回归模型中，T酶解X1、T超声X2和M酶X3为影响因子，提取率Y 为项目指标，该模型为：

图4 各因素交互作用对提取黄酮类物质的影响Fig.4 The interaction of various factors on the impact of the extraction of flavonoids

通过对上面的公式做方差分析，得到0.96（R2），0.91（离均差），进行LM 回归分析优化后模型的系数检验后发现，各系数显著性比响应面优化前均要好许多，显著性水平比较理想。

表4 LM 回归分析优化后模型的系数检验Table 4 LM regression coefficient test optimization model

由RSREG Procedure 分析得到一个极值点，该点为X1=0.131 3、X2=0.939 4、X3=0.515 2，即M酶的添加量为0.05 g，T酶解为60 min 和T超声为20 min 时提取率最高。

3 结论

石榴花中黄酮类物质的提取率与T酶解，T超声和M酶添加量有着直接的关系，我们可以通过试验得到，T酶解在50 min 到70 min，T超声在15 min 到25 min，M酶添加量在0.04 g 到0.06 g 这个范围内时，黄酮具有较高的提取率，经过响应面分析法的优化，得到超声20 min、酶解60 min、加0.05 g 酶时，可以使1.00 g 干石榴花中黄酮类物质获得最高的提取率，在最佳实验条件下重复实验，最终获得石榴花中黄酮类物质提取率最高为60.49%。

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