液质联用法测定婴儿乳粉中双酚A和己烯雌酚

刘艳琴，王浩，杨红梅，郭启雷，史海良，田艳玲

（国家食品质量安全监督检验中心，北京 100094）

双酚A 简称双酚基丙烷（BPA），在工业上双酚A被用来合成聚碳酸酯（PC）和环氧树脂等材料。聚碳酸酯是一种透明的硬塑料，它常用来作为单体合成聚碳酸酯塑料，这种材料可以用来加工成塑料接触制品。双酚A 可以通过包装材料进入食品或化妆品中，进而进入人体，造成人类和野生动物的内分泌系统、免疫系统、神经系统出现异常，还会严重干扰人类和动物的生殖遗传功能。研究已经证实，低剂量的BPA（10-7mol/L）即能引起支持细胞和精子细胞死亡。己烯雌酚是一种人工合成的雌性激素类药物，常当做性激素调节动物的生理功能，还被用作动物饲料添加剂，以促进动物的生长。己烯雌酚是人工合成的非甾体雌激素，属于雌激素及孕激素类药物。它在促进动物蛋白质的合成代谢、提高动物日增重和减少脂肪等方面效果明显，另外具有增加瘦肉率、排出死胎以及提高饲料转化率等功能而广泛应用于畜牧业。将其添加到饲料里可以提高产崽率或催情作用，同时通过饲喂会使己烯雌酚残留在牛奶中。国内外研究表明，己烯雌酚可以破坏机体的遗传物质，导致基因突变，引发肿瘤。由于目前还没有婴幼儿配方乳粉中双酚A 和己烯雌酚残留的国家标准检测方法，还不能完成科学监管，保护广大婴幼儿的健康和利益。因此，及时寻求简便、快速、准确、敏感性高的婴幼儿配方乳粉中双酚A 和己烯雌酚残留的检测方法才能保障食用婴幼儿配方乳粉的卫生和安全。

目前，测定双酚A 和己烯雌酚残留的文献比较多，方法主要是气相-质联用法[1-4]、高效液相色谱法[5-8]和液相-质联用法等[9-12]。气相色谱-质谱联用法存在前处理步骤繁琐、有机试剂消耗量大、测定周期长等缺点；液相色谱法虽然对仪器要求不高，但检出限不高，而且不能满足确证要求；液相色谱-质谱联用技术是近年来新兴的检测技术，由于其准确、高效和高灵敏度，符合目前食品安全检测所追求的快速高效的要求。目前还未见液相色谱-串联质谱联用法用于同时检测双酚A 和己烯雌酚的报道。本文采用碱性乙腈提取目标物，采用高效液相色谱串联质谱仪进行检测，前处理简单，灵敏度高，适合于婴幼儿配方乳粉中双酚A 和己烯雌酚残留的同时快速检测。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

甲醇和乙腈：色谱纯，德国Fisher 公司；双酚A，己烯雌酚：w≥99%，美国Sigma 公司；实验所选用样品为作者单位检验样品；其他试剂均为国产分析纯。Agilent 6410 型串联三重四极杆质谱仪，配Agilent1200型液相色谱仪：美国Agilent 公司；RE-2000 型旋转蒸发器：上海市亚荣生化仪器厂；KQ-5200 型超声波清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；TGL-16M 型高速台式冷冻离心机：湘仪离心机仪器有限公司；Milli-Q 去离子水发生器：美国Milli-Q 公司。

1.2 标准溶液的配制

标准储备液：分别称取适量的双酚A 和己烯雌酚标准品，分别用甲醇配成0.1 mg/mL 的标准储备液，该溶液在-18 ℃保存。

标准工作溶液：用甲醇将标准储备液稀释成1.0 μg/mL。

空白样品提取液：选择阴性样品，按1.5 操作。

基质混合标准工作溶液：根据仪器的灵敏度和线性范围，吸取一定量的标准工作溶液，用空白样品提取液配成系列浓度的基质混合标准工作溶液。

1.3 色谱分析条件

色谱柱：资生堂MGⅢ-C18柱，1.8 μm，2.1mm×150 mm。

条件：流速0.25 mL/min，柱温25 ℃，进样量20 μL，流动相：甲醇（A）+10 mmoL/L 乙酸铵缓冲溶液（B）；梯度洗脱：0～3 min，B 保持80%，3 min～15 min，B 由80%线性递减至5%，15 min～21 min，B 保持5%，21.0 min～20.1 min，B 由5%线性递增至80%，21.1 min～25.0 min，B 保持80%。

1.4 质谱分析条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应检测；干燥气：N2；雾化气压力：275.8 kPa；干燥气温度：325 ℃；干燥气流速：8 L/min；汽化温度：340 ℃。

1.5 样品处理

称取4.0 g 样品，精确至0.01 g，置于100 mL 比色管中，加水35 mL，充分溶解后超声提取5 min，再用含1%氨水的乙腈溶液定容。超声波提取20 min，上清液经滤纸过滤，吸取25 mL 滤液至100 mL 蒸发瓶内，并将其接至旋转器上，于45 ℃水浴中减压蒸馏至1 mL左右，加含2 %氨水的甲醇溶液充分溶解后定容至5 mL，滤纸过滤后待测（如浑浊严重，以8 000 r/min 高速离心10 min，取上清液过滤膜）。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件选择

为了充分提取样品中双酚A 和己烯雌酚残留，本实验首先分别选择乙腈、甲醇、乙酸乙酯等做为样品提取溶液，试验结果均不理想，随后经过反复试验，发现含1%氨水的乙腈能有效地提取样品中目标化合物，同时能有效除去样品中的蛋白质，因此，选择此溶液作为样品提取液。此外，实验还发现，只有当定容溶液为碱性时，才能充分溶解目标化合物，所以本方法选择含2%氨水的甲醇溶液作为样品的定容溶液。

2.2 基质效应的影响

化学分析中，基质指的是样品中被分析物以外的组分。基质常常对分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性。为了消除测定液中存在的基质效应，考虑到双酚A 和己烯雌酚为ESI 负电离模式，采用含2%氨水的甲醇溶液作为样品溶解液，很大程度上减小了测定液中的基质效应，同时提高了检测灵敏度。分别用空白样品测定液及含2%氨水的甲醇溶液配制成浓度为0.01 μg/mL 双酚A 和己烯雌酚标准溶液，通过二者响应值的比较来确定基质效应。实验发现，双酚A 和己烯雌酚的基质效应分别为74.5%和70.8%，这说明实际样品中的基质效应不会对双酚A 和己烯雌酚的定性定量测定造成较大的干扰。

2.3 色谱条件的优化

色谱柱的选择：为了有利于色谱峰的分离及锋形的改善，本方法分别采用资生堂MGⅢ-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）、ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱和ZORBAX SB-Aq 色谱柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）进行分离试验，发现资生堂MGⅢ-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）效果较好。

流动相的选择：实验发现用水作水相流动相时，双酚A 色谱峰易展宽，因此本方法采用10 mmoL/L 乙酸铵溶液-甲醇为流动相，利用梯度洗脱的方法提高分离及检测效果效果，测试开始时，流动相中10 mmoL/L乙酸铵溶液-甲醇的比例为80 ∶20，然后在0～3 min 保持此将比例，这一部分主要是洗脱测定液中极性较强的杂质，3 min～15 min 内将改变二者的比例为5 ∶95，这一部分主要是洗脱测定液中的中等极性杂质，15 min～21 min 保持此比例，这一部分主要是洗脱测定液中双酚A 和己烯雌酚。通过上述两步梯度，在21 min 内，可以较好的分离测定液中双酚A 和己烯雌酚，结果见图1。

图1 双酚A 和己烯雌酚的加标MRM 色谱图Fig.1 MRM chromatogram of a blank sample spiled with Bisphenol A and diethylstilbestrol

2.4 质谱条件的优化

采用直接进样方式将浓度为100 ng/mL 的双酚A和己烯雌酚注入离子源中，在负离子检测方式下进行母离子全扫描，得到双酚A 和己烯雌酚的分子离子峰。根据欧盟2002/657/EC 指令规定对于质谱确证方法必须达到4 个确证点的要求，低分辨液相色谱-质谱联用仪检测应在确定母离子的基础上选择两个以上的子离子。以该离子峰为母离子，进行二级质谱扫描，最后采集全扫描的二级质谱图，得到碎片离子信息，然后再对得到的二级质谱参数如破碎电压、碰撞能量等进行优化，使定性离子与定量离子产生的离子对强度比例达到最大时为最佳。得到双酚A 和己烯雌酚的最佳质谱参数，结果见表1。

2.5 线性关系及检出限

用空白样品提取溶逐级稀释的标准工作液，分别进样20 μL，测定结果经线性回归[y 为峰面积，Counts；x为浓度，（μg/L）]，同时用空白样品进行加标实验，在信噪比均大于3 的条件下能检出，将此添加量定为检出限，结果见表2。

表1 双酚A 和己烯雌酚的质谱参数Table 1 Parameters of mass spectra of Bisphenol A and diethylstilbestrol

表2 双酚A 和己烯雌酚的线性方程、线性关系、相关系数及检出限Table 2 The linear equation，correlation coefficient and limits of detection for Bisphenol A and diethylstilbestrol

从表2 可以看出，双酚A 和己烯雌酚在1 μg/L～25 μg/L 浓度范围内高度线性相关（相关系数＞0.999），检出限低（5 μg/kg），可以满足实际检测要求。

2.6 方法的回收率和精密度

每组准确称取空白样品6 份，每份4.0 g，共3 组，分别定量加入双酚A 和己烯雌酚标准物质，添加水平分别为5、25、250 μg/kg。按供试品溶液制备方法制备后进行测定，结果见表3。

表3 加标样品回收率与相对标准偏差（n=6）Table 3 Recovery and relative standard deviation（RSD）of in spiled sample（n=6）

从表3 中可看出，不同浓度平均加标回收率80.6 %～102.9%，平均相对标准偏差为1.29%～8.83%（n=6）。图1 为加标样品中MRM 色谱图。

3 结论

建立了婴幼儿配方乳粉中双酚A 和己烯雌酚的液相色谱-串联质谱测定方法。该法样品加标回收率80.6%～102.9%，平均相对标准偏差为1.29%～8.83%（n=6），方法的灵敏度和准确度均满足实际样品检测的需要。

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