响应面法优化荞麦蜂花粉中黄酮类物质的提取

赵娟娟

（衡水学院 生命科学系，河北衡水 053000）

黄酮类化合物是以黄酮（2-苯基色原酮）为母核而衍生的一类黄色色素。它在植物界分布很广，在植物体内大部分与糖结合成苷类或碳糖基的形式存在，具有抗菌及抗病毒，抗肿瘤，抗氧化自由基，抗炎、镇痛，保肝护肝等多种生物活性[1]。

蜂花粉中的黄酮主要以游离态黄酮苷元存在，其中荞麦蜂花粉内黄酮含量较高，从中提取黄酮类化合物无毒、安全，是一种优良的黄酮潜在资源[2]。对荞麦蜂花粉黄酮类物质提取工艺条件进行了研究，并取得了较好的效果，为荞麦蜂花粉的开发利用提供参考。

1 材料和设备

1.1 材料

荞麦蜂花粉：市售；95%乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠均为分析纯：衡水瑞丰化学试剂公司。

1.2 设备

UVmini-1240 紫外可见分光光度计：日本岛津；HH-1数显恒温水浴锅：江苏省金坛市医疗仪器厂；FA1004N电子天平：上海精密科学仪器有限公司。

2 方法

2.1 荞麦蜂花粉黄酮产品制备的工艺流程

荞麦蜂花粉→预处理→乙醇浸提→用紫外分光光度计测黄酮类物质的含量

2.2 荞麦蜂花粉黄酮含量的测定方法

提取液0.5 mL 加5%亚硝酸钠0.3 mL，混匀放置6 min 加硝酸铝0.3 mL，混匀放置6 min 加4%的氢氧化钠4 mL，再向其中加30%的乙醇溶液补足至10 mL，测定波长为510 nm，以30%的乙醇作为标样进行吸光度的测定[3-4]。

2.3 提取率的测定方法

将处理好的荞麦蜂花粉多次浸提，直至提取液吸光度基本为零，可认为黄酮类物质全部提出。分别收集各级提取液并测定其体积（V，mL）和吸光度值（A）。

式中：V 为提取液体积；A 为提取液稀释后的吸光度。

2.4 荞麦蜂花粉中黄酮类物质的提取

2.4.1 单因素试验

以乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间为单因素，考察各因素对黄酮类物质提取率的影响。

2.4.2 响应面试验

根据Box-Behnken 中心组合设计原理，以荞麦蜂花粉中黄酮类物质提取率为响应值，设计三因素三水平共15 个试验点的响应面分析试验。试验1-12 为析因试验，13-15 为中心试验[5-6]。响应面试验设计见表1。

表1 Box-Behnken 实验设计Table 1 Factors and levels in Box-Behnken central composite design

3 结果与分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 乙醇浓度的确定

在料液比为1 ∶20，温度为70 ℃条件下，分别加入不同浓度乙醇（60%、70%、80%、90%）浸提1.5 h。乙醇浓度对提取效果的影响见图1。

图1 乙醇浓度对提取效果的影响Fig.1 Effect on extracted result of ethanol concentration

由图1 可以看出，随着乙醇浓度上升，吸光度逐渐升高，乙醇浓度达到80%以后，其吸光度呈逐渐下降趋势。因此，选择80%乙醇溶液提取。

3.1.2 料液比的确定

在醇浓度为80%，提取温度70 ℃条件下，以不同料液比（1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30）浸提1.5 h。料液比对提取效果的影响见图2。

图2 料液比对提取效果的影响Fig.2 Effect on extracted result of ratio between material and liquid

由图2 可知，料液比太小难以保证原料中的黄酮全部转移到液相中，提取率较低。但料液比过大不仅消耗大量溶剂，而且后续浓缩耗时耗能。由此选择料液比为1 ∶20。

3.1.3 提取温度的确定

在乙醇浓度为80%，料液比为1 ∶20 条件下，不同温度（50、60、70、80 ℃）提取1.5 h。温度对提取效果的影响见图3。

由图3 可知，50 ℃至70 ℃之间随着温度的升高黄酮的吸光度增加显著，在70 ℃达到最高。当温度过高，造成细胞中有其他杂质溶出，导致吸光度下降，因此选择在70 ℃下提取。

图3 温度对提取效果的影响Fig.3 Effect on extracted result of temperature

3.1.4 提取时间的确定在乙醇浓度为80%，料液比为1 ∶20，温度为70 ℃条件下，分别提取不同时间（0.5、1、1.5、2、2.5 h）。提取时间对提取效果的影响见图4。

图4 提取时间对提取效果的影响Fig.4 Effect on extracted result of time

由图4 可知，提取时间在0.5 h～1 h 吸光度呈急速上升趋势，1 h～3 h 吸光度呈平缓略升趋势。平缓说明提取已接近平衡，且略升度较小，从工业角度考虑为节省时间应选择1 h 为提取时间，可进行多次提取。

3.2 响应面试验分析结果

3.2.1 响应面试验结果见表2。

表2 响应面试验结果Table 2 Experimental results of BOX-Behnken

根据表2 的试验结果，通过SAS 软件处理将各因素回归拟和后得到回归方程。该试验的回归方程为Y=0.886 956+0.037 516·X1+0.023 434·X2+0.005 53·X3-0.090 421·X1·X1-0.002 165·X1·X2+0.004 381·X1·X3-0.050 973·X2·X2-0.029 326·X2·X3-0.052 376·X3·X3

3.2.2 回归方程的方差分析

采用SAS RSREG 程序对表2 数据进行ANOVA分析，分析结果见表3。

表3 回归方程各项的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

该方程回归显著，模型的R2=95.85%，说明回归方程的拟合程度良好。由表3 中的P 值可知道，方程中X1，X1X1，X2X2，X3X3对Y 值的影响达极显著水平，X2，X2X3对Y 值影响达显著水平。表明试验因子对响应值不是简单的线性关系，二次项对相应值也有很大的关系。交互项系数均不显著，所以交互作用的影响相对较小。

3.2.3 响应面直观分析

各个因子交互作用的响应面和等高线图见图5。

从图5 可以直观地看出料液比、温度的交互作用不大，并发现时间轴向等高线变化密集，而料液比轴向等高线的变化相对稀疏，故料液比对响应值峰值的影响较时间影响大。当温度位于中心水平时，时间和料液比的交互作用不大。当料液比位于中心水平时，时间和温度有交互作用但不显著。

3.2.4 最佳提取条件的确定

由SAS 分析得到，响应值（Y）最大时，与其相对应的荞麦蜂花粉的最佳提取条件为料液比为1 ∶21.2，温度为73.2 ℃，时间为58.9 min。理论最佳荞麦蜂花粉提取率为89.3%。为了检验响应面法的可行性，采用得到的最佳提取条件进行验证试验，3 次平行试验得到的实际提取率为88.7%与理论值相差0.6%＜1%，说明该方程与实际情况拟合很好，充分验证了所建模型的正确性。

图5 各个因子交互作用的响应面和等高线图Fig.5 The response surface and contour map of interaction between every two factors

4 结论

从安全性和实用性考虑乙醇浸提法安全性高且易于实现大规模应用。通过单因素实验和响应面法优化，研究得到对荞麦蜂花粉中黄酮类物质提取的最佳条件为：乙醇浓度80%、料液比1 ∶21.2、提取温度73.2 ℃、提取时间58.9 min，提取率最高，可达达88.7%。荞麦蜂花粉可作为开发黄酮类物质的优质原料。

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