微生物学实验综合模块的设计研究

（韶关学院 英东生命科学学院，广东 韶关512005）

微生物学是本科生物技术和生物科学专业重要的专业基础主干课程之一，该课程的理论性和实践性均较强.为了加深学生对理论知识和操作技能的理解和掌握，微生物学实验教学显得尤为重要.目前，韶关学院的微生物学实验教学主要采用传统的教学模式，即每次实验课均为独立的实验内容，实验之间缺乏联系性和系统性；授课过程中，指导教师将实验目的、实验原理、操作步骤和注意事项等内容按部就班地灌输给学生，学生利用已准备好的器材，按照指导教师安排的实验流程和操作步骤一成不变的完成；最后学生抄写实验指导书上的内容和自己的实验结果完成实验报告.采用这种教学模式进行实验教学，学生的学习积极性不高，基本是以应付教师的心态来完成实验；并且学生不能系统和完整地掌握微生物学的基本理论知识和操作技能.因此，近年来，笔者和教研室同仁们针对性地对各个年级的部分班级开展综合性实验的改革和尝试，为提高地方院校应用型人才的培养质量方面进行积极探索，并为打造校级《微生物学》精品课程奠定坚实的基础.现将本教研室开展的微生物学综合实验的具体内容和安排介绍如下.

1 综合实验模块的各个实验组成和安排

1.1 玻璃器皿的清洗、包扎，培养基的配制及灭菌

在实验中，学生首先要学习清洗微生物学实验中常用玻璃器皿的方法，如使用过或者未使用的培养皿、试管、三角瓶和移液管，并且学会对这些玻璃器皿的常规包扎方法.试管棉塞的制作等.在实验中需要配制多种的培养基［1］（具体见表1）、分装、灭菌和无菌检测，以备后面的实验使用.由于配制培养基种类较多，因此采用学生分组配制不同培养基的教学方式，但是要求不同组别之间的同学相互交流.通过实验的实施，可以提高学生对该实验的重视程度和学生对实验的积极性，由于实验失败会导致后面一系列实验均不能顺利的实施完成，可以使学生体会到器皿的清洗包扎、配制培养基的重要性.

表1 论各种培养基的名称、配方和目的

1.2 产蛋白酶菌株的筛选、纯化及保藏

实验课前，要求学生到学校附近有机质较多地方采集土壤样品；为了确保实验的成功，安排部分学生采集屠宰场下水道附近的土壤样品.采集土壤时，应采集耕作层的土壤样品，并且利用已灭菌的三角瓶收集.将采集的土样进行不同程度的稀释，然后采用混菌法或涂布法将稀释液添加到牛奶培养基中，37℃培养48 h后，观察牛奶培养基平板上菌落的生长状况、以及菌体周围水解圈的大小，要求学生挑取1～2个产生水解圈最大的菌株.由于挑选的菌落不一定是单菌落，因此要求学生将挑取的菌落在牛肉膏蛋白胨平板培养基上划“Z”型线分离，37℃培养18～24 h后，挑取菌落，直至挑到单菌落为止.挑取的单菌落采用两种方式进行保藏：（一）接种单菌落于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，37℃培养24 h后于4℃斜面保藏.（二）接种单菌落于牛肉膏蛋白胨液体培养基，37℃培养24 h后，添加灭菌甘油制备冻存管后于-20℃或-70℃保藏.该实验的教学改变了常规教学实验中目的性不强的土壤中微生物的分离实验，并且学生也进一步掌握了对微生物菌株的保藏方法.在对产生蛋白酶菌株的纯化过程中，可能部分学生需要多次的实验才能得到单菌落，这使学生知道科学研究不是一蹴而就，需要研究者的耐性和恒心.

1.3 产蛋白酶菌的革兰氏染色及镜检

安排学生将分离获得的菌株进行革兰氏染色镜检观察菌株的革兰氏类型、菌株的形态结构（杆状、球状或者螺旋状）、产生芽孢情况以及菌体大小等方面.为了确保学生实验结果的正确性，在实验中，指导教师示范操作革兰氏染色的过程，并且提供典型的革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌）的染色结果，这有利于学生的感性认识.要求学生对分离获得菌株染色时，在载玻片上必须对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌同时染色，只有这两种标准菌株获得正确的染色结果后，才能根据分离获得的未知菌株的染色结果判断其革兰氏类型.传统的教学中以革兰氏染色标准菌株作为实验对象，学生在实验之前就知道实验结果，因此缺乏对实验的兴趣；而通过这种方式促使学生具有对自己分离菌株的形态结构和革兰氏染色类型等方面具有好奇心，这可提高学生对实验的兴趣.在本次实验之中，由于后面的鉴定实验结果对该次实验结果的验证，因此这要求学生必须认真操作，这也加强了学生的责任心.

1.4 产蛋白酶菌的PCR鉴定

目前分子生物学的迅速发展，测定细菌的16S rDNA序列是鉴定微生物分类地位的关键依据，也是常用的鉴定手段.通过本次实验，使学生掌握了对细菌基因组的提取制备，然后以基因组为模板进行PCR扩增的内容让学生初步掌握分子生物学技术在微生物上的应用.安排学生在实验前一天，接种菌株到牛肉膏蛋白胨液体培养基中37℃振荡培养，实验课中离心收集菌体，随后提取菌体基因组DNA，然后进行PCR反应.对于 16S rDNA PCR 扩增采用的引物是：上游引物(27F)：5’-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物(1492R)：5-TACCTTGTTACGACTT-3’［2］；PCR 反应程序：94℃预变性 3 min，然后进行 30 个循环，每个循环程序为94℃变性30 s，50℃退火60 s，72℃延伸 2 min，最后72℃延伸 5 min，扩增获得PCR产物大小约为1.5 kb；然后将该PCR产物进行纯化后，送至测序公司测序.由于传统的微生物学实验教学中未开设该实验内容，并且也未涉及到任何分子微生物学基础技术；因此，增加该实验内容改变学生认为微生物学与分子生物学似乎没有任何关系的错误认识，并且也掌握了分子微生物中基本操作技术.

1.5 16S rDNA序列的比对及其分析

该实验内容主要是要求学生学会对测序结果的拼接和分析.将测序公司获得的细菌16S rDNA测序结果运用Genbank数据库中的Blast程序进行比对分析，然后根据序列比对结果可初步鉴定学生分离获得的菌株为与Genbank数据库中的同源性达到99%～100%的16S rDNA菌株应该为分类地位一致的菌株.通过该实验内容的教学实施，使学生掌握了部分生物信息学软件的使用以及DNA序列的同源比对分析；该实验使学生初步的了解涉及生物信息学的内容.由于目前生物信息学是一门发展迅速的学科，该学科是一门交叉学科，为剖析生命现象本质的生命科学研究工作者共同关注的焦点，是今后生命科学发展的重要学科组成部分之一.通过该实验内容的可使学生了解到微生物学科与其他学科的紧密联系，也对生物信息学的具体应用具有一定的了解和掌握.

1.6 产蛋白酶细菌的生理生化鉴定

安排学生根据第四次实验和第五次实验的初步鉴定结果，参考细菌鉴定分类手册(如东秀珠和蔡妙英主编的《常见细菌系统鉴定手册》)中相应种属的微生物生理生化实验指标，选取全部或部分指标开设相应的生理生化鉴定实验，比如V-P、鸟氨酸脱羧酶、明胶液化和多种糖类的产酸产气实验.由于鉴定过程中涉及生理生化指标较多，因此实验内容较多；将全班学生分为多个组别进行不同的实验指标内容，学生之间必须相互交流观察不同的实验结果，最后归纳统一全部的实验结果.比较学生的实验结果是否与鉴定手册上的指标结果一致，实验结果一致表明该菌株是该属种的菌株.对于菌株的鉴定需采用标准菌株作为实验的参考对象；而实验室未有的标准菌株根据购买菌株的费用、实验时间的安排等多方面的实际因素相结合是否安排学生进行实验，但是学生必须知道实验之中一定需要用标准菌株作为参考对象.

1.7 产蛋白酶菌的培养优化实验

本次实验安排学生采用液体培养方式研究不同的碳源、氮源、金属离子和起始pH值等因素对分离获得的菌株产生蛋白酶量的影响［3］.实验中的基础培养基配方为：葡萄糖40 g，蛋白胨 20 g，Na2HPO41.4 g，CaCl20.6 g，MgSO40.4 g，水1 000 mL.碳源实验是以等量的蔗糖、葡萄糖、玉米粉和淀粉代替基础培养基中的葡萄糖；氮源实验是以等量的牛肉膏、干酪素、(NH4)2SO4、蛋白胨和大豆豆粕代替基础培养基中的蛋白胨；金属离子实验是去掉基础培养基中的Na2HPO4、CaCl2和MgSO4，然后分别添加0.001 mol/L的CuSO4、Zn-SO4、MgSO4、K2SO4、MnSO4和FeSO4等无机盐；起始pH值实验是分别调节基础培养基的起始pH值为6.0、7.0、8.0、9.0和10.0.实验前安排学生首先将菌株接种至基础培养基中37℃培养24 h后作为种子菌，按5%的接种量分别接种至上述不同实验培养基，培养基的装液量为250 mL三角瓶中装25 mL液体培养基量，37℃、250 r/min振荡培养后，离心收集菌体沉淀称其湿重，并且收集上清液后，采用Folin-酚法测定其酶活.该实验的实施使学生认识培到培养条件对微生物菌株的生长及其代谢产物的影响显著，并且使传统的培养条件对微生物生长的验证性实验改为了研究型实验.

1.8 筛选菌株的诱变选育

在微生物中自发突变的概率极低，变异程度轻微，从自然界中直接筛选获得能够满足实际应用的高产菌株的几率较低；因此，在实际生产中常常采用紫外诱变和化学诱变的手段对菌株进行诱变选育处理，从而获得高产的菌株.本实验采用紫外诱变和化学诱变的方法对分离获得的菌株进行诱变处理，以期获得产蛋白酶量提高的菌株.安排学生上课前一天接种菌株于牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行振荡培养过夜备用；采用化学诱变剂亚硝基胍的处理过程如下：取振荡过夜的菌液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，然后挑取少许亚硝基胍粉末点于平板上，待粉末溶解，平板于37℃倒置培养至有明显的菌落长出后，从亚硝基胍边缘取菌苔于牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行2～6 h的中间培养过程.然后将菌悬液稀释后涂布于牛奶培养基表面，37℃培养1～2 d，测量并计算水解圈的直径与菌落直径之比，通过与出发菌株比较是否具有产生蛋白酶量提高的突变菌株［1］.对于紫外诱变处理的过程如下：将菌悬液离心收集菌体后，通过紫外灯照射进行诱变处理，涂布于牛奶培养基表面，采用化学诱变计算的方法比较与其出发菌株产生蛋白酶是否有提高的突变菌株.最后还要求学生评价两种诱变方法的效果.通过该实验使学生了解紫外线和化学诱变剂均可诱导基因的突变，并且掌握这两种较为有效的的提高目的菌株生产性能的方法.

2 实验的考核与不足

由于该综合实验是一个连续的过程，实验内容之间的关联性和逻辑性较强，中间环节的每一次实验均需要获得成功才能较顺利实施下一步实验；因此，在考核学生时，将学生每次实验的实验结果作为重要的衡量指标.对于实验报告的书写，改变常规将每个实验都书写为一个实验报告的方式，而是要求学生将所有的实验内容整合在一起，并且按照发表论文的格式进行书写，即写出论文摘要、前言、方法材料、实验结果与讨论和结论几个部分.因此学生的实验考核成绩主要由学生的实验态度、动手操作技能、每次实验结果和实验论文等几个部分组成.

对于采用上述方式开设综合性的教学实验也存在一些不足和问题：（1）对于教师和学生而言，与常规开设的实验内容相比均增加了较大的工作量.（2）实验过程中，部分学生可能不能获得理想结果，因此需要学生之间相互帮组，学生之间共享一些实验结果.总之，对于微生物学实验开设综合性实验可以全面系统地提高学生的理论知识及其操作动手能力，并且使学生懂得和理解科学研究的不易，同时也能享受科学研究成功带来的喜悦.

［1］沈萍,陈向东.微生物学实验［M］.4版.北京:高等教育出版社,2010.

［2］罗剑飞.硫氧化菌群落结构分析及其特性研究［D］.广州：华南理工大学，2011:32.

［3］欧平,梁静娟,庞宗文.一株产大豆蛋白酶的芽孢杆菌发酵条件的优化［J］.食品研究与开发,2011,32(2):133-139.