ATP 结合盒转运子A1 R219K 基因多态性与飞行员血脂异常的关系

罗 丹，冯 戟，马红雨，董 昭，王 婷，蔡 庆

对动脉硬化发病机制及脂代谢异常的研究发现，三磷酸腺苷结合盒转运子A1(ATP－binding cassette transporter A1，ABCA A1)被认为与脂代谢密切相关，ABCA1 R219K 的基因多态性可能与升高高密度脂蛋白及降低三酰甘油相关，但是国内外的研究仍存在争议［1，2］。飞行员血脂异常发生率较高，为27.2%［3，4］，本研究旨在探讨飞行员人群中ABCA1 R219K 基因多态性分布的特点及其与血清脂类的关系，从分子水平进一步认识脂代谢紊乱。

1 对象与方法

1.1 对象 选取男性飞行员199 例，年龄21 ～55岁。分为血脂异常组91 例，年龄:22 ～53 岁，平均(35.43 ±8.36)岁;血脂正常的108 例作为对照组，年龄:21 ～55 岁，平均(35.41 ±8.71)岁，两组年龄具有可比性(P ＞0.05)。血脂异常的判定严格按照高脂血症诊断标准［5］。排除标准:近期服用降脂药物，具有高血压、心、脑、糖尿病等疾病家族史者，体检证实患有高血压、心、脑、肝、肾疾病者。

1.2 标本采集 空腹12 h 后采集2 管静脉血，分别注入含分离胶的真空采血管，3000 r/min 离心10 min，分离血清用于检验;EDTA－2K 抗凝管用于提取DNA 及ABCA1 R219K 多聚酶链式反应限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism ，PCR－RFLP)测定。

1.3 生化检验 应用日立7180 生化分析仪，检测前进行伯乐化学质控及血脂质控，质控均在在控前提下，进行总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL－C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL－C)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)等检测。

1.4 ABCA1R219K 基因多态性检测 含有EDTA－2K 抗凝药的血样，采用人类外周血基因组提取试剂盒提取DNA，用多聚酶链式反应(PCR)和限制性片段长度多态性测定ABCA1 R219K 基因多态性。

1.5 模板DNA 的提取 取EDTA－2K 抗凝血2 ml，用FICOLL 单个核细胞提取液提取外周血淋巴细胞，用QIAGEN 公司DNA 提取试剂盒提取基因组DNA。

1.6 PCR 扩增 扩增ABCA1 R219K 基因引物由北京赛百盛生物技术公司合成，序列参考文献［6］:

上游引物:5'－GTA TTT TTG CAA GGC TAC CAG TTA CAT TTG ACA A－3'

下游引物:5'－GAT TGG CTT CAG GAT GTC CAT GTT GGA A–3'

将PCR 反应管置于PCR 扩增仪(PE9600 型，美国)进行PCR 扩增。扩增体系包括:上下游引物0.5 μmol/L，dNTP200 μmol/L，10 ×buffer 5 μl，Taq酶2.5 U，基因组DNA0.5 μg，总体积50 μl。反应体系循环条件为95 ℃预变性5 min，再进行以下循环:95 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s 循环35 次，72℃延伸10 min。取5 μl PCR 扩增液于2% 琼脂糖电泳，紫外灯下观察结果。琼脂糖电泳鉴定后4 ℃保存待酶切。

1.7 限制性酶切和电泳鉴定 限制性酶切体系为20 μl，PCR 产物10 μl，用限制性内切酶EcoNI 15 U，10 × NEBuffer4 含(BSA)2 μl (为BIOLABS 公司)，酶切相应PCR 产物，37 ℃消化过夜。2% 琼脂糖电泳，紫外灯下观察结果，进行ABCA1R219K 判读。

1.8 统计学处理 所有数据均采用SPSS17.0 软件进行统计学检验，计数资料采用χ2检验;计量资料以±s 表示，采用成组t 检验和方差分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组生化指标的比较 两组TC、TG、LDL－C存在统计学差异(P ＜0.01)，其他指标无统计学差异(P ＞0.05，表1)。

表1 血脂异常组与对照组飞行员的生化指标比较(±s)

表1 血脂异常组与对照组飞行员的生化指标比较(±s)

各项指标血脂异常组(n=91)对照组(n=108)P 24.68 ±9.71 25.75 ±16.07 0.713 AST(U/L)22.48 ±6.08 22.97 ±7.72 0.397 Cr(μmol/L)73.79 ±12.89 75.95 ±14.24 0.397 BUN(mmol/L)5.44 ±1.055.24 ±0.74 0.220 Glu(mmol/L)5.19 ±0.645.02 ±0.43 0.085 TC(mmol/L)4.95 ±0.944.40 ±0.66 ＜0.01 TG(mmol/L)2.53 ±1.581.13 ±0.47 ＜0.01 HDL－C(mmol/L) 1.15 ±0.331.24 ±0.29 0.172 LDL－C(mmol/L)ALT(U/L)3.14 ±0.722.77 ±0.57 ＜0.01

2.2 两组样本PCR 结果及限制性片段长度多态性测定

2.2.1 PCR 结果 两组所有标本的PCR 产物都在177 bp 处出现了目的条带，见图1。

图1 ABCA1 R219K PCR 结果

2.2.2 ABCA1 R219K 基因多态性测定结果 PCR产物经序列检测证实与酶切结果一致，其中1 为RR型(177 bp)，2 为RK 型(177，107，70 bp)，3 为KK型(107，70 bp)，见图2。

图2 限制性片段长度多态性测定

2.3 两组ABCA1 R219K 的基因型比较 经过Hardy－Weinberg 平衡验证，两组样本具有群体代表性，实际频数与理论频数无统计学差异(P ＞0.05)，ABCA1 R219K 基因多态性分布均符合Hardy－Weinberg定律(表2)。总体基因型频率分别为RR(31.2%)，RK(50. 7%)，KK(18. 1%)，等位基因频率为R(56.5%)，K(43.5%)。两组ABCA1R219K 基因型的分布频率比较，差异无统计学意义(χ2=4.197，P =0.123);两组ABCAIR219K 等位基因的分布频率比较，无统计学差异(χ2=2.564，P=0.109)，见表3。

表2 飞行人员ABCA1 R219K Hardy－Weinberg 平衡检验(n;%)

表3 飞行人员血脂异常组与对照组ABCA1 R219K 基因型及等位基因频率比较(n;%)

2.4 血脂异常组不同基因型与血脂的关系 血脂异常组ABCA1 R219K 不同基因型的个数分别为RR 型26 例，RK 型43 例，KK 型22 例。血脂异常组RR，RK，KK 基因型的HDL－C 水平相互比较，存在统计学差异(P=0.027)。不同基因型的TC、TG、LDL－C相互比较，差异无统计学意义(P ＞0.05，表4)。

表4 飞行人员血脂异常组不同基因型与血脂的关系(mmol/L;±s)

表4 飞行人员血脂异常组不同基因型与血脂的关系(mmol/L;±s)

注:与RR 组比较，①P ＜0.05

血脂RR 型RK 型KK 型P TC4.80±1.005.08±1.024.87±0.72 0.631 TG2.23±0.822.82±2.082.30±1.01 0.449 HDL－C 1.10±0.231.23±0.421.44±0.11①0.027 LDL－C3.23±0.793.08±0.753.13±0.61 0.834

3 讨论

本研究中血脂异常组与对照组比较，ABCA1 R219K 在基因型与等位基因上的差异无统计学意义，表明两组基因型及等位基因分布无差异。其中等位基因K 频率为43.5%，与国内外研究结果比较，成都汉族人群为46.0%［7］、新疆维吾尔族男性40.1%［8］、广西壮族人群36.0%［9］，德国人26%［10］、荷兰人25.4%、芬兰人22%［11］、美国人28%［12］，可见不同研究的等位基因频率结果不同，造成等位基因频率差异的原因可能与种族、地域、遗传背景等因素有关。

本研究表明，血脂异常组飞行员的KK 基因型HDL－C 明显高于其他两种基因型，差异具有统计学意义(P ＜0.05)，这与文献［3，13］报道的结果一致。原因是ABCA1 在胆固醇逆转运过程中起第一步限速作用，是胆固醇逆转运的门卫［14］，在巨噬细胞上，ABCA1 作为ATP 结合盒转运子，通过ATP 结合域结合ATP，使细胞内的胆固醇转移至细胞外，并与细胞外的apoAI 结合，apoAI 参与形成前βHDL，形成成熟的HDL。ABCA1 R219K 是ABCA1 编码序列常见多态性，是7 号外显子第1051 位核苷酸由G变成A，使ABCA1 蛋白质第219 位的精氨酸(R)变成赖氨酸(K)。由于HDL 属于内源性生成，受饮食影响较小，笔者认为ABCA1 219 KK 基因型升高血清中HDL－C 的结果比较客观，机制可能为ABCA1 R219K 基因变异使ABCA1 蛋白的活性提高，有利于HDL 的生成，从而起到抗动脉硬化及降低冠心病风险的作用，与文献［15－17］报道一致。ABCA1 R219K 不同基因型对不同降脂药物的应答敏感性不同，KK 基因型比其他基因型具有明显升高HDL水平的作用，差异具有统计学意义［18，19］。因此，本研究推测ABCA1 不同基因型检测可能用于患者的个体化治疗。另外，血脂异常组中RK 基因型的HDL－C 低于KK 基因型，而高于RR 基因型，虽然差异没有统计学意义，但笔者认为可能与样本例数有限有关，推测RK 基因型可能引起HDL 轻度升高，RK 基因型与HDL－C 水平之间关系值得进一步探讨。

ABCA1 219K 不同基因型TG 水平差异无统计学意义。在本研究中没有观察到ABCA1 219K 有降低TG 的效果，分析原因可能为:TG 可能受工作环境的影响，尤其是飞行员这一特殊群体，工作长期处于一个封闭的空间，注意力高度集中，交感神经兴奋，可能对TG 水平有一定的影响;另外，TG 可能受生活方式、样本例数、饮食等因素影响，因此ABCA1 219K 与TG 的关系有待进一步探讨。

本研究证实，血脂异常组与对照组比较，ABCA1 R219K 在基因型与等位基因上的分布并无差异。ABCA1 R219K 多态性分析中，KK 基因型能够明显升高血清中HDL－C，故笔者认为通过检测ABCA1 R219K 基因型可能为飞行员心、脑血管疾病的预防及个体化治疗提供新思路、新方法。

［1］ Ma X Y，Liu J P，Song Z Y，et al. Associations of the ATP－binding cassette transporter A1 R219K polymorphism with HDL－C level and coronary artery disease risk:a meta－analysis［J］. Atherosclerosis，2011，215(2):428－434.

［2］ 刘亚洋，郭志刚，屠 燕，等. ABCA1 基因编码区SNP 检测及R1587K 与血脂和冠心病的关系［J］. 解放军医学杂志，2006，31(4):300－302.

［3］ 刘 浩，吕晓宁，李鸣皋. 海军飞行员代谢性疾病患病情况及其影响因素调查［J］.武警医学，2011，22(6):485－487.

［4］ 马春梅，叶道斌，毛积分，等. 中青年冠状动脉粥样硬化危险因素分析［J］. 武警医学，2012，23(4):309－311.

［5］ 中国成人血脂异常防治指南制订联合委员会. 中国成人血脂异常防治指南［J］. 中华心血管病杂志，2007，35(5):390－419.

［6］ Clee S M，Zwinderman A H，Engert J C，et al. Common genetic variation in ABCA1 is associated with altered lipoprotein levels and a modified risk for coronary artery disease［J］.Circulation，2001，103(9):1198－1205.

［7］ 吴 银，白 怀，刘 瑞，等.中国人内源性高三酰甘油血症患者ATP 结合盒转运子A1 基因R219K 多态性研究［J］.中华医学遗传学杂志，2007，24(2):177－181.

［8］ 孙明慧，马依彤，谢 翔，等.ABCA1 基因R2 1 9 K 多态性在新疆维吾尔族、汉族分布特征及与血脂水平关系［J］. 中华实用诊断与治疗杂志，2011，25(1):14－17.

［9］ 黄 健，戴 玲，马义丽，等. 广西壮族人群ABCA1基因R219K 和I883M 多态性的分布［J］. 医学分子生物学杂志，2007，4 (6):507－510.

［10］ Evans D，Beil F U. The association of the R219K polymorphism in the ATP－binding cassette transporter 1(ABCA1)gene with coronary heart disease and hyperlipidaemia［J］. J Mol Med (Berl)，2003，81(4):264－270.

［11］ Singaraja R R，Brunham L R，Visscher H，et al.Efflux and atherosclerosis:the clinical and biochemical impact of variations in the ABCA1 gene［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23(8):1322－1332.

［12］ Benton J L，Ding J，Tsai M Y，et al. Associations between two common polymorphisms in the ABCA1 gene and subclinical atherosclerosis:Multi－Ethnic Study of Atherosclerosis［J］. Atherosclerosis，2007，193(2):352－360.

［13］ Huang Y，Wu Y，Liu R，et al. Differential effect of ATP binding cassette transporter A1 R219K and cholesteryl ester transfer protein TaqIB genotypes on HDL－C levels in overweight/obese and non－obese Chinese subjects［J］. Acta Cardiol，2011，66(2):231－237.

［14］ Oram J F，Lawn R M.ABCA1:the gatekeeper for eliminating excess tissue cholesterol［J］. J Lipid Res，2001，42(8):1173－1179.

［15］ Jiang Z，Zhou R，Xu C，et al. Genetic variation of the ATP－binding cassette transporter A1 and susceptibility to coronary heart disease［J］. Mol Genet Metab，2011，103(1):81－88.

［16］ Li Y，Tang K，Zhou K，et al. Quantitative assessment of the effect of ABCA1 R219K polymorphism on the risk of coronary heart disease［J］. Mol Biol Rep，2012，39(2):1809－1813.

［17］ Li Y Y，Zhang H，Qin X Y，et al. ATP－binding cassette transporter A1 R219K polymorphism and coronary artery disease in Chinese population:a meta－analysis of 5，388 participants［J］. Mol Biol Rep，2012，39(12):11031－11039.

［18］ Li J，Wang L F，Li Z Q，et al. Effect of R219K polymorphism of the ABCA1 gene on the lipid－lowering effect of pravastatin in Chinese patients with coronary heart disease［J］. Clin Exp Pharmacol Physiol，2009，36(5－6):567－570.

［19］ Tsai M Y，Ordovas J M，Li N，et al. Effect of fenofibrate therapy and ABCA1 polymorphisms on high－density lipoprotein subclasses in the Genetics of Lipid Lowering Drugs and Diet Network［J］. Mol Genet Metab，2010，100(2):118－122.