HPLC法测定格列齐特缓释胶囊的含量和有关物质

许煜静，张庆伟，彭秋燕，李翔宇，郝 旖，杨金荣

（天津医科大学药学院，天津市临床药物关键技术重点实验室，天津300070）

格列齐特为第二代磺酰脲类口服降糖药，主要作用于胰岛β细胞，能显著地降低血糖水平,恢复胰岛素生理性的分泌模式，并通过提高胰岛素对靶组织的敏感性，改善胰岛素抵抗[1-3]。缓释微丸胶囊是一种新剂型，属剂量分散型剂型,与单剂量剂型相比，能够迅速分布于整个胃肠道，使生物利用度提高并减小局部刺激，提高患者服药的依从性[4]。中国药典2010年版二部收录了格列齐特片（规格为80 mg/片）的质量标准，未收录格列齐特缓释制剂。本文参考中国药典2010年版二部格列齐特片的含量测定和有关物质测定方法[5]，色谱条件优化后应用于格列齐特缓释胶囊含量和有关物质的测定，结果表明该方法专属性强，结果准确可靠，可有效控制药品质量。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1.1.1 仪器 美国Waters公司2487双波长紫外检测器高效液相色谱仪，色谱柱Eclipse XDB-C8（4.6×150 mm，5 μm，Agilent公司）。

1.1.2 试药 格列齐特原料药（宁波利民康药业有限公司，批号201101），格列齐特对照品（中国药品生物制品检定所，批号201004），1-（3-氮杂双环[3.3.0]辛基）-3-邻甲苯磺酰脲（格列齐特杂质Ⅰ，中国食品药品检定研究院，批号201101），格列齐特缓释胶囊（3批，自制，批号 20120401，21020404，20120406），乙腈、三氟乙酸（色谱纯，J&K Scientific LTD），三乙胺（分析纯，J&K Scientific LTD）。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件与系统适用性实验 色谱柱E－clipse XDB-C8（4.6×150 mm，5 μm），柱温 35 ℃，流动相乙腈-水-三乙胺-三氟乙酸（39∶61∶0.1∶0.1），流速 1.0 mL·min-1，进样量 20 μL，检测波长 235 nm。分别精密量取格列齐特供试品和格列齐特杂质Ⅰ对照品适量，用40%乙腈溶液配制成含格列齐特0.2 μg·mL-1和格列齐特杂质Ⅰ0.3 μg·mL-1的溶液，作为系统适应性试验溶液。取该溶液20 μL进样，在该色谱条件下，理论塔板数按格列齐特主峰计算不低于3000，格列齐特色谱峰与格列齐特杂质Ⅰ色谱峰的分离度应符合要求。

1.2.2 溶液的制备

1.2.2.1 供试品溶液Ⅰ：取本品内容物研细，精密称取粉末适量（约相当于格列齐特100 mg），置100 mL量瓶中，加乙腈40 mL，超声溶解15 min，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，续滤液作为供试品溶液Ⅰ。

1.2.2.2 自身对照溶液：精密量取供试品溶液Ⅰ2mL，置100mL量瓶中，用40%乙腈溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，在40%乙腈溶液稀释至刻度，摇匀，作为自身对照溶液。

1.2.2.3 供试品溶液Ⅱ：精密量取供试品溶液Ⅰ5mL，置25mL量瓶中，用40%乙腈溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液Ⅱ。

1.2.2.4 对照品溶液：精密称取格列齐特对照品约20 mg，置100 mL量瓶中，加乙腈40 mL，超声溶解后，加水稀释至刻度，摇匀。

1.2.3 专属性考察

1.2.3.1 空白辅料干扰试验：称取格列齐特缓释胶囊全辅料适量，照1.2.2.1项下方法配制，在上述色谱条件下进样20 μL，记录色谱图。另分别精密量取供试品溶液Ⅱ和对照品溶液进样，记录色谱图。

1.2.3.2 破坏性试验：（1）酸破坏：称取相当于格列齐特100 mg的供试品粉末，置于100 mL量瓶中，加入0.01 mol·L-1的盐酸10 mL，在80℃水浴中加热30 min后，冷却，酸破坏溶液用0.1 mol·L-1的氢氧化钠溶液调至中性。（2）碱破坏：称取相当于格列齐特100 mg的供试品粉末，置于100 mL量瓶中，加入0.1 mol·L-1的氢氧化钠溶液10 mL，在100℃水浴中60 min后，冷却，用0.1 mol·L-1的盐酸调节至中性。（3）氧化破坏：称取相当于格列齐特100 mg的供试品粉末，置于100 mL量瓶中，加入0.3%的双氧水10 mL后，在80℃水浴中30 min后，冷却。

上述酸、碱、氧化破坏溶液，照1.2.2.1项下“加乙腈40 mL……”起，制备供试溶液，取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。

1.2.4 线性关系和范围 精密称取格列齐特对照品100.0 mg，同1.2.2.4项下配制方法，配制成1.00 mg·mL-1储备液。精密量取对照品溶液储备液2.0、3.5、5.0、6.5和8.0 mL用40%乙腈溶液稀释至25 mL，摇匀，在上述色谱条件下进样20 μL，测定峰面积，绘制标准曲线。

1.2.5 精密度 取浓度约为200 μg·mL-1的供试品溶液连续进样6次，每次20 μL，测定精密度。

1.2.6 回收率测定 分别精密称取格列齐特80、100和120 mg，置100 mL量瓶中，用40 mL乙腈超声溶解，再分别加入相当于100 mg处方量的辅料粉末，加水稀释至刻度，摇匀。分别移取5 mL，置25 mL量瓶中，用40%乙腈溶液稀释至刻度，摇匀。过滤后分别进样20 μL，记录峰面积，计算回收率。

1.2.7 稳定性考察

1.2.7.1 含量测定稳定性考察：取供试品溶液Ⅱ，室温放置，分别于 0、2、4、6、8、24h 时进样，记录色谱图。

1.2.7.2 有关物质稳定性考察：取供试品溶液Ⅰ，室温放置，分别于 0、2、4、6、8、24h 时进样，记录色谱图。

1.2.8 检测限 取自身对照溶液作为储备液，逐步稀释，在上述色谱条件进样20 μL，测定检测限。

1.2.9 含量测定 取样品3批，照1.2.2.3项下方法制备，并取对照品溶液，在上述色谱条件下分别进样20 μL，测定峰面积。用外标法计算含量。本品含格列齐特应为标示量的93%~107%[5]。

1.2.10 有关物质测定 取样品3批，照1.2.2项下供试品溶液Ⅰ和自身对照溶液配制方法制备，分别进样20 μL，以外标峰面积不加校正因子主成分自身对照法计算有关物质相对含量。单个杂质峰面积不得大于自身对照溶液主峰面积，各杂质峰面积的和不得大于自身对照溶液主峰面积的2倍[5]。

2 结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验 系统适用性试验结果表明，在1.2.1项色谱条件下，格列齐特色谱峰与格列齐特杂质Ⅰ色谱峰的分离度为1.98。见图1。

2.2 专属性考察

2.2.1 空白辅料干扰试验 结果表明，空白辅料不干扰格列齐特的测定。见图2。

2.2.2 破坏性试验 样品溶液的酸、碱、氧化破坏色谱图与未破坏图比较，结果显示，各条件下的降解产物和本品主峰均能达到完全分离。

图1 系统适用性实验（1格列齐特，2格列齐特杂质Ⅰ）

图2 空白辅料干扰试验结果（1格列齐特）

图3 破坏性试验结果（1格列齐特）

2.3 线性关系和范围 以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y=44846x+134539，相关系数r=0.9998，结果表明格列齐特在80.08~320.32 μg·mL-1浓度范围内，线性关系良好。

2.4 精密度 精密度考察结果的RSD值为0.10%（n=6），表明精密度良好。

2.5 回收率 格列齐特的回收率为100.37%，RSD为0.54%，符合方法学要求。见表1。

2.6 稳定性

2.6.1 含量测定稳定性 格列齐特峰面积RSD值为1.01%，表明格列齐特在24 h内稳定。

2.6.2 有关物质稳定性 结果显示总杂质峰面积在0~6 h内RSD<2%，6 h后RSD>2%，因此在有关物质检查时样品溶液应临用现配，不能超过6 h。

表1 含量测定的回收率考察结果

2.7 检测限 经过多次稀释，格列齐特的检出限为8.76 ng。

2.7 样品含量测定和有关物质测定 样品含量和有关物质测定结果见表2。

表2 格列齐特含量和有关物质测定结果

3 讨论

3.1 有关物质测定的方法学研究中，总杂质在6 h内基本稳定，杂质峰以格列齐特杂质Ⅰ变化最为明显，但6 h内均未超过0.2%的限量，可以认为基本稳定。因此采用本方法测定格列齐特缓释胶囊的有关物质时，样品溶液需临用现配。

3.2 在酸、碱、氧化破坏实验过程中发现格列齐特经过同样浓度酸、碱破坏后，在碱性溶液中较稳定，在酸性溶液中不稳定，主成分峰减小太多；氧化条件剧烈时，主峰甚至消失，失去破坏性试验意义，提示本品易氧化分解。本文调整盐酸的浓度至0.01 mol·L-1和双氧水浓度至0.3%时，使其适度降解（10%～20%），主峰与降解物或降解物间分离度良好；通过试验发现加热破坏的程度远远小于酸、碱、氧化破坏的程度。

［1］吴德云，陈明卫.格列齐特缓释片对胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能的影响[J].实用糖尿病杂志，2009，1（2）:37

［2］丁平，查伟.格列齐特缓释片治疗2型糖尿病的临床研究近况[J].实用中西医结合临床，2007,7（5）:92

［3］苏红丽.格列齐特缓释片治疗老年2型糖尿病的疗效与安全性观察[J].中国现代药物应用，2012,6（2）:48

［4］张蓉，方瑜，曹德英.格列齐特缓释微丸胶囊的制备及体外释放度考察[J].制剂技术，2006,15（10）:27

［5］国家药典委员会.中国药典[S].二部.北京：中国医药科技出版社，2010:810-811