正交设计优化枳实中3 种二氢黄酮苷的提取工艺

尹明晓，张金杰，翁远超，赵庆春*

枳实始载于《神农本草经》，为芸香科植物酸橙(Citrus aurantium L.)及其栽培变种或甜橙(Citrus sinensis Osbeck)的干燥幼果，具有破气消积、化痰散痞的功效［1］。本品的主要成分为二氢黄酮苷类。为了有效提取其有效成分，本实验采用乙醇提取方法，用L9(34)正交表设计试验，优化枳实中3 种二氢黄酮苷的最佳提取工艺。

1 材料与仪器

1.1 材料 枳实购于沈阳四方大药房，经沈阳药科大学教授孙启时教授鉴定为芸香科植物甜橙的干燥幼果。乙腈为色谱纯;醋酸、磷酸均为分析纯(国药集团);水为5 次蒸馏水(试验自制)。柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷均从枳实中分离得到，均通过核磁鉴定，纯度＞98%，符合分析定量要求。

1.2 仪器 Waters 600 controller、Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector(美国waters 公司);十万分之一分析天平(日本SHIMADZU AUW120D);数显恒温水浴锅(丹瑞HH-D4);粉碎机(屹立)。

2 方法与结果

2.1 柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷的含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取柚皮苷对照品4.8 mg、新橙皮苷对照品4.5 mg、橙皮苷对照品6.0 mg，置50 mL 量瓶，加50%乙醇溶解，定容至刻度，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取滤液备用。

2.1.2色谱条件色谱柱:Welchrom C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相:乙腈-0.5%磷酸溶液(18 ∶72)［2］;检测波长:283 nm;柱温:30 ℃;流速:1.0 mL/min。

2.1.3 供试品溶液的制备 取枳实粉末10 g，精密称定，置100 mL 圆底烧瓶中，加入10 倍量50%乙醇，回流提取1 次，每次1.5 h，合并滤液，水浴蒸干，分别用50%乙醇溶解，置10 mL 量瓶，定容至刻度，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。

2.1.4 线性范围的考察 精密吸取对照品溶液10、20、30、40、50、60、70 μL，分别定容至50 mL 量瓶，摇匀。吸取上述溶液10 μL 进样，每份进样3次，记录色谱峰面积。以对照品溶液浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，3个峰的理论塔板数均＞5 000，分离度均＞1.5，符合试验标准。见表1、图1。

2.1.5 精密度实验 精确吸取3 种黄酮苷标准品溶液各10 μL，连续进样6 次，记录色谱图，计算峰面积RSD 分别为2.1%、1.7%、0.8%，表明精密度符合要求。

2.1.6 稳定性实验 取枳实样品，按“2.1.3”项方法处理，分别0、2、4、6、8、12、24 h测定，记录色谱图，计算峰面积RSD 分别为2.0%、1.8%、1.6%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

表1 枳实中柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷的线性回归方程

图1 样品液相色谱图

2.1.7 重复性实验取枳实粉末6 份，按“2.1.3”项方法处理，在上述色谱条件下测定，记录色谱图，计算峰面积RSD 分别为2.7%、2.5%、2.3%，结果表明，本方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率实验 称取枳实粉末10 份，每份1.0 g，精密称定。其中1 份不加对照品，作为随行对照;其余9 份中，3 份为1 组，分别加入高、中、低3 个浓度的柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷对照品，进样10 μL。记录色谱图，加样回收率分别为100.9%、102.2%、102.3%。RSD 分别为1.13%、1.10%、0.78%，符合试验标准。

2.2 正交试验筛选枳实中3 种二氢黄酮苷的提取工艺［3］

2.2.1 提取工艺中单因素的考察 ①乙醇浓度考察:取4 份枳实粉末各10 g，精密称定，置100 mL 圆底烧瓶中，分别加入30%、40%、50%、60%乙醇提取。结果表明，50%乙醇提取效果最好。②乙醇用量考察:取4 份枳实粉末各10 g，精密称定，置100 mL 圆底烧瓶中，分别加入8、10、12、14 倍量的50%乙醇。提取相同时间，结果表明，10 倍量体积的乙醇提取效果较好。③提取时间考察:取4 份枳实粉末各10 g，精密称定，置100 mL 圆底烧瓶中，分别加入10 倍量的50%乙醇。分别提取1、1.5、2、2.5 h，结果表明，1.5 h 的乙醇提取效果较好。④提取次数考察:取4 份枳实粉末各10 g，精密称定，置100 mL 圆底烧瓶中，分别加入10 倍量的50%乙醇。分别提取1、2、3 次，每次提取1.5 h。结果表明，提取2 次较好。

2.2.2 正交实验设计 称取枳实药材10 g，以乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数为影响因素，根据预实验的结果设定3 个水平，以1 g 药材中所含有的柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷的含量为指标，按照L9(34)正交表进行试验［4］，见表2。

表2 正交实验因素

2.2.3 结果 正交试验结果、方差分析见表3、表4。由表3、表4 可见，根据综合评价标准，A ＞(B =C)＞D。因此，最佳提取工艺为A2B1C2D1。即8 倍量的50%乙醇提取1 次，每次提取1.5 h。

表3 正交实验设计表格

表4 方差分析结果

2.3 验证试验 按照上述优选工艺，提取3 批药材，计算柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷含量(见表5)。

表5 验证试验结果

3 讨论

本试验对枳实中3 种主要有效成分—柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷的提取工艺进行了优化。采用正交设计试验的方法，确定了乙醇浓度、提取时间、提取次数以及乙醇用量4 个影响因素，确定了最佳提取工艺为8 倍量的50%乙醇提取1 次，每次提取时间为1.5 h。结果表明，该方法提取枳实中的3 种二氢黄酮苷类化合物，工艺简单、提取率高、操作容易，为枳实的工业生产提供了合理的依据。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［S］.北京:化学工业出版社，2005:816-817.

［2］ 姜华，李军，石任兵，等.HPLC 法测定枳实黄酮有效部位中3种二氢黄酮的含量［J］.中国药房，2008，27(2):2127-2128.

［3］ 谢贞建，焦士蓉，唐鹏程，等.枳实总黄酮提取工艺的响应面法优化［J］.食品研究与开发，2009，30(7):41-44.

［4］ 胡静，尚海花，王阳，等.正交试验优选枳实中辛弗林提取工艺［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(13):22-23.