不同生境及采样部位对南方红豆杉活性成分含量的影响

于少帅，孙启武，田胜尼，柏培磊，邵剑文，张小平，①

(1. 安徽师范大学安徽省重要生物资源保护与利用研究重点实验室生物环境与生态安全安徽省重点实验室，安徽芜湖241000;2. 中国林业科学研究院林业研究所国家林业局林木培育重点实验室，北京100091;3. 安徽农业大学生命科学学院，安徽合肥230036)

植物次生代谢产物与人类生活关系密切，在医药、食品、轻化工等领域应用广泛，因而次生代谢物的种类、代谢途径及代谢机制等问题的探讨越来越受到研究者关注。植物的次生代谢是植物在长期进化中与环境(生物和非生物)相互作用的结果，次生产物在植物提高自身保护和生存竞争力、协调与环境的关系等方面有重要作用，其产生和变化比初生代谢产物与环境有着更强的相关性和对应性［1－2］。此外，植物次生代谢产物的产生和分布通常具有产地、生长期和器官组织等方面的特异性［3－4］。因此，对植物次生物质与环境的关系及其在植物体内分布规律的研究对于植物资源合理、有效的利用具有重要的意义。

紫杉醇及其类似物是红豆杉属(Taxus Linn.)植物的次生代谢产物，具有独特的抗癌特性，已成为国内外研究热点。红豆杉属植物中紫杉醇含量变异较大，相关的研究也较多。柏培磊等［3］认为:不同产地南方红豆杉〔Taxus wallichiana var. mairei (Lemée et Lévl.)L. K. Fu et Nan Li〕枝叶中紫杉醇含量的差异与其生长环境的差异有关;苏建荣等［5］的研究结果表明:温度和光照等因子对云南红豆杉(T. yunnanensis W. C. Cheng et L. K. Fu)中紫杉醇含量的影响较大;程广有等［6］对东北红豆杉(T. cuspidate Sieb. et Zucc.)的研究结果表明:东北红豆杉不同群体的紫杉醇含量差异显著，与环境因子存在相关性;常醉等［7］认为:东北红豆杉中紫杉醇及其类似物含量在植株中有明显的分布规律;柯春婷等［8］的研究结果显示:在福建产南方红豆杉中，紫杉醇含量与气候因子的相关性不显著;杨逢建等［9］认为:栽培南方红豆杉的生长发育及其紫杉醇含量与环境因子存在相关性。尽管有不少研究者对紫杉醇含量的变异机制进行了研究，但由于采样的局限性及人为管理的影响，难以获得紫杉醇含量变异与生境因子相关性的明确研究结论。

南方红豆杉是中国特有植物，探究不同生境对南方红豆杉中紫杉醇等次生产物含量的影响及其在不同组织部位的分布规律，对于全面了解红豆杉属植物中抗癌成分的分布规律及其与生境因子的关系、合理开发红豆杉资源等具有重要意义。为明确生境因子(坡向、海拔、气候和土壤等)对南方红豆杉活性成分含量的影响，作者对不同生境南方红豆杉枝叶中紫杉醇、7－木糖紫杉醇和三尖杉宁碱含量进行分析，探讨其与生境因子的关系;并对南方红豆杉植株不同部位及冠层中3 种成分的含量进行了比较，以阐明它们在不同器官中的分布规律，为南方红豆杉资源的合理开发应用及栽培管理提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 材料

根据实验要求于2011 年4 月对浙江、福建和江西的7 个南方红豆杉天然种群生境进行调查，记录群落内的物种种类、数量及相关生态学参数并采集样品;采集部位为枝头部位的枝叶及距地面约1.5 m处的树皮，每一样地选择32 株样株;每个样地随机采集0 ～40 cm 深土样3 份。各样地的基本概况见表1。

表1 供试南方红豆杉产地基本概况1)Table 1 Basic status of location of Taxus wallichiana var. mairei (Lemée et Lévl.)L. K. Fu et Nan Li tested1)

依据研究目的的不同，在7 个产地中分别选择特殊样地和部位进行样品采集。在福建建阳和漳平以及江西景德镇分别选择不同坡向(阴坡和阳坡)采集枝叶样品，每一样地选择15 株样株，株龄均超过100 a;在浙江龙泉及江西宜丰和景德镇分别选择不同坡位(高、中、低)采集南方红豆杉枝叶样品，每一样地选择14 株样株，株龄均超过100 a;在福建建阳和浙江武义分别采集茎皮和枝叶样品，每一样地选择株龄相近的样株10 株;在福建明溪选择同一植株分别采集不同冠层(高、低)的枝叶样品，每一样地选择株龄相近的样株6 株。

仪器:美国安捷伦1200 高效液相色谱系统(包括G1322A 型脱气机、G1312A 型二元泵、G1329A－ALS型自动进样器、G1316A－TCC 型柱温箱和G1365DMWD 型紫外检测器);KQ－250E 型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司);DHG－9246A 型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);SENCO－R型旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司);DFY－250型摇摆式高速粉碎机(温岭市林大机械有限公司);MILLI－Q 超纯水纯化系统(美国 Millipore 公司)。

试剂:紫杉醇对照品购自桂林晖昂生化药业有限责任公司(产品编号JF20090301，纯度99.9%);7－木糖紫杉醇和三尖杉宁碱对照品由中国林业科学研究院林业研究所提供;甲醇和乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 HPLC 色谱分析条件 采用 Ultimate C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)。 流动相为 V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)= 23∶36∶41，流速 1.0 mL·min－1，检测波长227 nm，进样量10 μL，柱温箱温度30 ℃。

1.2.2 标准曲线绘制 分别精确称取紫杉醇、7－木糖紫杉醇和三尖杉宁碱对照品 2.500 0、4.687 5 和3.125 0 mg，分别用甲醇溶解并定容，配制成质量浓度分别为 0.100 0、0.187 5 和0.125 0 mg·mL－1的对照品母液;取各对照品母液适量，用甲醇分别稀释为原质量浓度的1/2、1/4、1/8、1/16 和1/32，按上述 HPLC色谱条件进样分析。以峰面积为纵坐标Y、对照品质量浓度为横坐标X 绘制标准曲线，获得3 个对照品的线性回归方程。紫杉醇对照品的回归方程为 Y =38 554.432X－6.138(r=0.999 6)，线性范围 3.1 ～100.0 μg·mL－1;7－木糖紫杉醇对照品的回归方程为Y=4 892.879X+5.407(r=0.999 9)，线性范围 5.9 ～187.5 μg·mL－1;三尖杉宁碱对照品的回归方程为Y = 11 066.200X + 17.434(r = 0.999 5)，线性范围3.9 ～125.0 μg·mL－1。

1.2.3 供试液的制备和色谱分析 将样品于40 ℃烘干并粉碎，精确称取2.0 g粉末，加入V(丙酮)∶V(乙酸乙酯)= 1∶1 混合液 30 mL，超声提取 1 h，过滤，残渣按同法再提取1 次，过滤;合并滤液，于40 ℃减压蒸干;残渣加20 mL 二氯甲烷和20 mL 水，萃取3 次;合并二氯甲烷相，4 0 ℃减压蒸干，所得浸膏用10 mL 甲醇溶解，经 0.22 μm 微孔滤膜过滤，所得供试液按照上述方法进行HPLC 色谱分析。每份样品重复测3 次，以紫杉醇对照品为外标确定3 种成分峰，紫杉醇、7－木糖紫杉醇和三尖杉宁碱的保留时间分别为 23.380、14.334 和 20.631 min。

1.2.4 方法学考察

1.2.4.1 精密度实验 精确称取采自福建明溪的枝叶样品粉末2.0 g，按上述方法制成供试液，采用上述色谱条件连续进样测定5 次。紫杉醇、7－木糖紫杉醇和三尖杉宁碱含量的 RSD 分别为1.87%、0.26%和0.26%，表明本实验方法精密度良好。

1.2.4.2 稳定性实验 精确称取采自福建明溪的枝叶样品粉末2.0 g，按上述方法制成供试液，采用上述色谱条件每隔2 h 进样测定1 次(供试液低温避光保存)，共进样测定6 次。紫杉醇、7－木糖紫杉醇和三尖杉宁碱含量的 RSD 分别为1.99%、0.50%和0.36%，表明样品供试液在低温避光条件下保存12 h 基本稳定。

1.2.4.3 重现性实验 精确称取采自福建明溪的枝叶样品粉末5 份，每份2.0 g，按上述方法制成供试液，在上述色谱条件下进样检测，紫杉醇、7－木糖紫杉醇和三尖杉宁碱含量的RSD 分别为1.32%、2.49%和2.16%，表明本研究方法重现性良好。

1.2.5 土壤理化指标测定 参照文献［10－11］的方法对土壤电导率、pH 值、全N 含量、硝态N 含量、全P含量、速效P 含量、速效K 含量及土壤有机质含量进行测定。土壤各项理化指标的测定由安徽农业大学生命科学学院完成。

1.3 数据分析

采用SPSS 13.0 软件对实验数据进行单因素方差分析、多重比较和Pearson 相关性分析(P=0.05)。

2 结果和分析

2.1 采自不同坡向的南方红豆杉枝叶中3 种成分含量的分析

对采自福建建阳和漳平以及江西景德镇不同坡向样地的南方红豆杉枝叶中紫杉醇、7－木糖紫杉醇和三尖杉宁碱含量的分析结果见表2。总体上看，生长于阳坡的南方红豆杉枝叶中3 种成分的含量明显高于生长于阴坡的植株。其中，生长于阳坡的植株中紫杉醇和7－木糖紫杉醇含量分别为阴坡的1.5 ～2.3 倍和1.9 ～2.7 倍，在不同坡向间差异显著(P＜0.05);生长于阳坡的植株中三尖杉宁碱含量为阴坡的1.1 ～2.3 倍，差异不显著(P＞0.05)。由于不同坡向间光照条件的差异最为明显，因而推测南方红豆杉枝叶中紫杉醇等成分的积累对光照条件较为敏感。

表2 采自不同坡向的南方红豆杉枝叶中3 种成分含量的比较(±SE)Table 2 Content comparison of three compounds in branch and leaf of Taxus wallichiana var. mairei (Lemée et Lévl.)L. K. Fu et Nan Li collected from different slope aspects(±SE)

表2 采自不同坡向的南方红豆杉枝叶中3 种成分含量的比较(±SE)Table 2 Content comparison of three compounds in branch and leaf of Taxus wallichiana var. mairei (Lemée et Lévl.)L. K. Fu et Nan Li collected from different slope aspects(±SE)

产地Location坡向Slope aspect 3 种成分的含量/mg·g－1 Content of three compounds紫杉醇Taxol 7－木糖紫杉醇7-xylosyltaxol三尖杉宁碱Cephalomannine福建建阳 Jianyang，Fujian 阴坡 Shady aspect 0.048 2±0.000 4 0.180 5±0.003 3 0.064 8±0.001 4阳坡 Sunny aspect 0.073 7±0.000 4 0.441 2±0.003 2 0.098 2±0.001 5福建漳平 Zhangping，Fujian 阴坡 Shady aspect 0.032 8±0.000 4 0.106 7±0.002 6 0.064 7±0.001 1阳坡 Sunny aspect 0.068 5±0.000 5 0.292 5±0.003 7 0.069 2±0.001 6江西景德镇 Jingdezhen，Jiangxi 阴坡 Shady aspect 0.048 8±0.000 3 0.237 1±0.002 6 0.094 3±0.004 2阳坡 Sunny aspect 0.111 6±0.000 4 0.446 2±0.002 7 0.220 0±0.001 1

2.2 采自不同坡位的南方红豆杉枝叶中3 种成分含量的分析

对采自浙江龙泉及江西宜丰和景德镇不同坡位样地的南方红豆杉枝叶中紫杉醇、7－木糖紫杉醇和三尖杉宁碱含量的分析结果见表3。由表3 可见:在不同坡位生长的南方红豆杉枝叶中3 种成分的含量均有一定差异，但差异不显著(P＞0.05)。在浙江龙泉，生长于低坡位的南方红豆杉中3 种成分的含量均最高，生长于中坡位的南方红豆杉中3 种成分的含量均最低;而在江西宜丰及景德镇，南方红豆杉中3 种成分的含量总体上随坡位降低逐渐提高。由于不同坡位主要体现为海拔的差异，因而推测南方红豆杉枝叶中3 种成分含量随海拔升高呈一定程度的递减趋势。

表3 采自不同坡位的南方红豆杉枝叶中3 种成分含量的比较Table 3 Content comparison of three compounds in branch and leaf of Taxus wallichiana var. mairei(Lemée et Lévl.)L. K. Fu et Nan Li collected from different slope positions

2.3 不同产地南方红豆杉枝叶中3 种成分的含量及其与环境因子的相关性分析

对来源于不同产地的南方红豆杉枝叶中紫杉醇、7－木糖紫杉醇和三尖杉宁碱含量的比较结果见表4，3 种成分的含量与产地环境因子的相关性分析结果见表5。

由表4 可见:在7 个样地中，福建建阳和江西景德镇产南方红豆杉枝叶中紫杉醇含量较高，江西宜丰和浙江武义产的枝叶中紫杉醇含量较低;浙江武义和福建建阳产南方红豆杉枝叶中7－木糖紫杉醇含量较高，浙江龙泉产的枝叶中7－木糖紫杉醇含量较低;福建明溪和江西景德镇产枝叶中三尖杉宁碱含量较高，福建建阳产枝叶中三尖杉宁碱含量次之，江西宜丰产枝叶中三尖杉宁碱含量最低;总体上看，来源于福建建阳和江西景德镇的南方红豆杉枝叶中3 种成分的含量相对较高，产自浙江龙泉和江西宜丰的枝叶中3种成分的含量相对较低(表4)。单因素方差分析结果表明:来源于不同产地的南方红豆杉枝叶中3 种成分的含量差异显著(P＜0.05)，其中紫杉醇含量的差异达到极显著水平(P＜0.01)。

表4 不同产地南方红豆杉枝叶中3 种成分含量的比较(±SE)1)Table 4 Content comparison of three compounds in branch and leaf of Taxus wallichiana var. mairei (Lemée et Lévl.)L. K. Fu et Nan Li from different locations(±SE)1)

表4 不同产地南方红豆杉枝叶中3 种成分含量的比较(±SE)1)Table 4 Content comparison of three compounds in branch and leaf of Taxus wallichiana var. mairei (Lemée et Lévl.)L. K. Fu et Nan Li from different locations(±SE)1)

1)同列中不同的小写字母表示差异显著(P=0.05)Different small letters in the same column indicate the significant difference (P=0.05).

产地Location 3 种成分的含量/mg·g－1 Content of three compounds紫杉醇Taxol 7－木糖紫杉醇7-xylosyltaxol三尖杉宁碱Cephalomannine浙江武义 Wuyi，Zhejiang 0.042 1±0.001 5bc 0.372 5±0.003 2a 0.065 7±0.001 4d浙江龙泉 Longquan，Zhejiang 0.051 0±0.002 6ab 0.103 8±0.019 6b 0.064 9±0.002 1d福建建阳 Jianyang，Fujian 0.061 0±0.001 2a 0.310 9±0.003 3ab 0.081 5±0.001 4c福建明溪 Mingxi，Fujian 0.053 9±0.001 7a 0.207 6±0.004 8ab 0.133 0±0.002 1a福建漳平 Zhangping，Fujian 0.050 7±0.001 5ab 0.199 6±0.003 1ab 0.066 9±0.001 4d江西宜丰 Yifeng，Jiangxi 0.034 4±0.006 3c 0.283 1±0.013 4ab 0.059 0±0.002 7d江西景德镇 Jingdezhen，Jiangxi 0.060 6±0.001 1a 0.259 2±0.012 2ab 0.124 5±0.002 7b

表5 南方红豆杉枝叶中3 种成分的含量与环境因子的相关性分析1)Table 5 Correlation analysis between three compound contents in branch and leaf of Taxus wallichiana var. mairei (Lemée et Lévl.)L. K. Fu et Nan Li and environmental factors1)

相关性分析结果表明:三尖杉宁碱含量与土壤中全N 含量呈极显著的负相关性(P＜0.01)，与土壤有机质含量呈显著的负相关性(P＜0.05)，与其他因子的相关性均不显著;而紫杉醇和7－木糖紫杉醇含量与所有因子的相关性均未达到显著水平。

2.4 南方红豆杉不同部位及不同冠层中3 种成分含量的分析

南方红豆杉茎皮和枝叶以及高冠层枝叶和低冠层枝叶中3 种成分的含量分析结果见表6。结果表明:茎皮中紫杉醇、7－木糖紫杉醇和三尖杉宁碱的含量明显高于枝叶，分别约为枝叶的 1. 4、2. 5 和 2. 1倍，茎皮与枝叶中3 种成分含量的差异达到显著水平(P＜0.05)。高冠层枝叶中3 种成分的含量均高于低冠层枝叶，其中高冠层枝叶中紫杉醇含量为低冠层枝叶的2.0 倍;不同冠层枝叶中紫杉醇、7－木糖紫杉醇含量差异显著(P＜0.05)，而三尖杉宁碱含量差异不显著(P＞0.05)。

表6 南方红豆杉不同部位及不同冠层中3 种成分含量的比较(±SE)Table 6 Content comparison of three compounds in different parts and in different tree canopy layers of Taxus wallichiana var. mairei(Lemée et Lévl.)L. K. Fu et Nan Li (±SE)

表6 南方红豆杉不同部位及不同冠层中3 种成分含量的比较(±SE)Table 6 Content comparison of three compounds in different parts and in different tree canopy layers of Taxus wallichiana var. mairei(Lemée et Lévl.)L. K. Fu et Nan Li (±SE)

1)1:茎皮Bark;2:枝叶Branch and leaf;3:高冠层枝叶Branch and leaf in high layer of canopy;4:低冠层枝叶 Branch and leaf in low layer of canopy.

样号1)No. 1)3 种成分的含量/mg·g－1 Content of three compounds紫杉醇Taxol 7－木糖紫杉醇7-xylosyltaxol三尖杉宁碱Cephalomannine 1 0.081 9±0.000 5 0.460 2±0.003 9 0.134 3±0.001 6 2 0.058 2±0.000 4 0.180 5±0.003 3 0.064 8±0.001 4 3 0.048 8±0.000 3 0.237 1±0.002 6 0.094 3±0.004 2 4 0.024 7±0.000 6 0.217 6±0.003 5 0.087 6±0.001 6

野外调查发现:南方红豆杉天然植株的株高一般约为20 m，其高冠层处于群落空间的第2 层或第3层，林隙较大、遮光率较小;而其低冠层处于群落空间的较低层次，林隙较小、遮光率较大，加之其他伴生植物的影响，其低冠层枝叶所接受的光照明显低于高冠层枝叶。王昌伟等［12］认为:全光照条件下南方红豆杉中次生产物的含量高于30%遮光条件，全光照条件下南方红豆杉多年生植株中次生产物含量增加。由此可见，光照因素可能是导致南方红豆杉低冠层枝叶中次生产物含量低于高冠层枝叶的原因之一。

3 讨论和结论

上述实验结果表明:生境条件对南方红豆杉枝叶中次生代谢产物的含量有明显的影响;生长在阳坡的南方红豆杉枝叶中紫杉醇、7－木糖紫杉醇和三尖杉宁碱的含量明显高于阴坡，表明南方红豆杉中次生代谢物的含量与光照条件呈一定程度的正相关。常醉等［7］的研究结果表明:东北红豆杉冠层阴面枝中的紫杉醇和三尖杉宁碱含量低于阳面枝;鲍思伟等［13］认为:光照强度对紫杉醇含量有明显影响，较强的光照(全日照或适度遮阳)有利于紫杉醇积累，光照强度过低则会产生抑制作用;但Kelsey 等［14］的研究结果显示:生长于阴坡的短叶红豆杉(Taxus brevifolia Nutt.)针叶和树皮中紫杉醇和三尖杉宁碱含量显著高于阳坡，约为阳坡的1.8 倍。贺利中等［15］的研究结果表明:南方红豆杉1 年生幼苗喜阴，其生长需要适度荫蔽，在全光照条件下容易造成苗木灼伤;Pridnya 等［16］认为:红豆杉虽为耐阴植物，但在林隙或稀疏的冠层下生长更佳，过于荫蔽的环境则会抑制其幼苗生长并增加成树死亡率，最终导致其种群衰退。由此可见，较强的光照虽然有利于南方红豆杉次生产物的合成和积累，但对其植株的生长发育则有一定的抑制作用，因而，针对红豆杉属不同种类应进一步摸索出适宜的光照栽培条件。

海拔对植物的生长及产品品质均有一定的影响［17］。本研究结果显示:来源于不同产地不同坡位的南方红豆杉枝叶中紫杉醇、7－木糖紫杉醇和三尖杉宁碱的含量随坡位升高呈现一定的递减趋势，而产地的海拔高度与紫杉醇、7－木糖紫杉醇和三尖杉宁碱的含量呈微弱的负相关性，相关系数分别为－0.089、－0.521 和－0.363，表明低海拔有利于南方红豆杉枝叶中3 种成分的合成及积累。程广有等［6］的研究结果表明:东北红豆杉中紫杉醇含量与海拔呈负相关(r=－0.028)，与本研究结论基本一致。海拔的变化导致生境中温度、降水及光照等因子发生相应改变，从而影响植株中次生产物的代谢。

相关性分析结果表明:土壤中全N 及有机质含量与南方红豆杉枝叶中三尖杉宁碱的含量有极显著或显著的负相关性，也证实了“全N 及有机质含量对植物的生长有重要作用［18］”这一结论。

此外，在南方红豆杉植株的不同部位(不同冠层以及茎皮和枝叶)紫杉醇、7－木糖紫杉醇和三尖杉宁碱的含量有明显差异。提示在进行南方红豆杉活性成分含量分析时应注意采样部位的统一。

综上所述，南方红豆杉中紫杉醇、7－木糖紫杉醇和三尖杉宁碱含量与环境因子均有一定的相关性，但相关性不显著。由此无法归纳出某一环境因子对南方红豆杉活性成分含量影响程度的大小，而环境因子也可能仅是影响其次生代谢物含量的因素之一，因此，有必要结合分子生物学继续进行更深层次的研究。此外，根据上述研究结果，为保证南方红豆杉植株的正常生长及其有效成分的积累，建议可在其幼苗栽培过程中进行适度遮阳处理，且随幼苗生长逐渐缩短遮阳时间，同时适当降低栽培土壤中全N 和有机质含量。对于南方红豆杉天然种群，如果群落空间低层次的植物过于稀疏，可以通过人工种植一些占据群落空间较低层次的灌木或草本植物来增加群落较低层的荫蔽程度以促进红豆杉幼苗的生长;对于郁闭度较大的乔木林，如华东地区常见的毛竹－南方红豆杉(Phyllostachys edulis－Taxus wallichiana var. mairei)群落，可以采取适度砍伐毛竹等措施减少群落郁闭度、提高透光率，有利于成年南方红豆杉植株的生长及有效成分的合成及积累。

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