可乐猪RYR1基因的群体遗传特性分析*

张培，惠嫣婷，潘兰兵，刘若余

(贵州大学动物科学学院，高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳 550025)

猪应激综合症(Porcine Stress Syndrome，PSS)是猪在非特异性因子(运输、高温、合群等)作用下，发生的恶性高热(体温骤升至42～45℃)、呼吸急促、心跳过速、肌肉强直、后肢呈现痉挛性收缩、突然死亡、肉质变劣等征候群。PSS 易导致部分猪因应激而产生PSE 肉甚至死亡，给养猪业造成巨大的经济损失。据研究，PSS 主要受常染色体上隐性基因(Haln)控制，隐性纯合体表现对氟烷麻醉敏感，因而称为氟烷基因。Knudson等认为，兰尼啶受体(Rynodine Receptor，RYR1)基因是氟烷基因的主要候选基因［1］，RYR1基因cDNA中C1843→T1843碱基变异使氨基酸序列中第615位处的精氨酸变为胱氨酸［2］，引起兰尼啶受体发生结构和功能的改变，导致在应激状态下肌肉组织中Ca2+大量非正常释放，引起猪出现PSS［3－4］。研究显示，C1843→T1843变异导致了HhaI 酶切位点(5’GCG↓C3’，HalN)的改变，从而使正常猪和应激敏感猪RYR1基因的酶切片段出现多态，因此，目前多利用聚合酶链式－限制性片段长度多态性(PCR－RFLP)技术对该基因进行检测。

可乐猪是国家级保护的优良地方品种，主产于贵州省毕节市的喀斯特高寒山区，耐粗饲，抗逆性强，并且肉质优良，肉味鲜美，在部分肉质指标上优于香猪［3］，是云南宣威火腿和威宁火腿的主要加工原材料。为开发利用可乐猪的优良种质特性，本文采用PCR－RFLP 技术对可乐猪的氟烷基因进行检测，以了解氟烷基因在可乐猪群体中的分布情况，为可乐猪的保种、选育和开发利用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

试验所用的45份可乐猪耳组织样均采自毕节地区可乐猪保种场。用耳号钳取猪耳缘组织，浸泡于75%酒精溶液中，－20℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取采用酚－氯仿抽提法提取猪基因组DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度后－20℃保存备用。

1.2.2 引物设计与PCR 反应参照文献［5］中的引物序列，上游引物F 5’TCCAGTTTGCCACAGGTCGTACCA3’和下游引物 R 5’ATTCACCGGAGTTTAGTCTCTGA3’由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR 反应体系:上、下游引物(10 pmol/μL)各1.5μL，DNA 模板2μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，加ddH2O 至25μL;反应条件:预变性94℃4 min→(变性94℃50 s→退火58.2℃45 s→延伸72℃50 s)35个循环→延伸72℃10 min。PCR 产物利用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.3 RFLP 分析酶切总反应体系20μL:PCR产物8μL ，限制性内切酶HhaI 1.5μL(10U/μL)，缓冲液M 3μL，ddH2O 7.5μL ，37℃恒温过夜。酶切产物用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。

1.2.4 测序分析在进行RFLP 检测分离出不同基因型个体后，每种基因型随机抽取3个样本进行PCR 扩增及琼脂糖凝胶电泳检测，然后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析。

2 结果与分析

2.1 PCR 扩增

经过35个循环的PCR 扩增后，取出5μL的扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示。从图1可知，在659 bp 处出现单一的特异性条带，与目的片段大小相符，可用于后续试验。

图1 RYR1基因PCR 扩增结果Fig.1 Amplification result of RYR1gene

2.2 RFLP 检测

对扩增的PCR 产物用限制性内切酶HhaI 进行消化，酶切结果用10%聚丙烯凝胶电泳检测，结果见图2。从图2可知，在45个可乐猪样本中仅检测出两种基因型，没有发生突变的HalNN型(片段大小为493 bp和166 bp)有41头，有1个等位基因发生变异的HalNn型(片段大小为659 bp、493 bp和166 bp)个体有4头。

图2 RYR1基因的RFLP 检测结果Fig.2 RFLP detection results of RYRl gene

2.3 测序结果

对已进行RFLP 检测的不同基因型样本进行测序验证及序列比对，结果见图3。测序结果显示，两种基因型个体在HhaI 酶切位点处发现了C→T的碱基变异，其中HalNN基因型个体仅出现了碱基C的单一峰，而HalNn基因型个体的测序结果中显示出C/T的杂合峰，进一步证明了本研究中RFLP 检测结果的可靠性。

图3 不同基因型RYR1基因的测序检测结果Fig.3 Sequencing results of RYR1 gene in different genotypes

2.4 RYR1基因的基因型频率和基因频率

根据PCR－RFLP 检测结果判定基因型，并计算基因型频率和基因频率，如表1所示。由表1可知，RYR1基因的基因型频率和基因频率呈现偏态分布，HalNN基因型个体占多数为45头，频率为0.9111;而HalNn基因型个体较少为4头，频率为0.0889。因此，HalNN在可乐猪群体中为优势基因型。从基因频率来看，等位基因HalN的频率为0.9556，等位基因Haln的频率为0.0444，HalN为优势等位基因。

表1 RYR1基因的基因型频率和等位基因频率Tab.1 Genotype frequencies and allele frequencies of RYR1 gene

2.5 RYR1基因的群体遗传特性

对可乐猪RYR1基因的杂合度、多态信息含量等统计结果见表2。由表2可知，可乐猪RYR1基因的纯合度较高，为0.9151;从多态信息含量来看，可乐猪处于低度多态(PIC＜0.25)。适合性检验表明，可乐猪RYR1基因频率不符合期望比例(P＜0.05)，即可乐猪群体在该位点处偏离了Hardy－Weinberg 平衡。

表2 可乐猪RYR1基因的纯合度、杂合度、有效等位基因数、多态信息含量和χ2值Tab.2 Homozygosity (Ho)，Heterozygosity(He)，Effective number of alleles(E)，Polymorphism Information Content(PIC)and Chi square(χ2)of RYR1 gene in Kele pigs

3 讨论

本研究利用PCR－RFLP 技术对45头可乐猪进行了氟烷基因检测，结果未发现隐性纯合个体(Halnn)，仅检测出4头杂合体(HalNn)，这与学术界普遍认为的氟烷基因在中国地方猪种中只少量存在的观点相似［6－7］。本研究中Haln的基因频率为0.0444，大于朱锋钊等报道的结果［8］，这可能是由于选取了不同的可乐猪群体所致。据报道，氟烷基因主要分布在国外的一些瘦肉型猪种中。研究显示，德国、比利时长白以及皮特兰阳性率较高，可达70～100%，而杜洛克、大白猪、约克夏和汉普夏阳性率较低，一般低于10%。本研究在可乐猪群体中未检测出氟烷阳性个体，说明近年来对可乐猪的保种选育工作具有一定的成效。

氟烷基因对猪肉质影响较大，但研究表明杂合个体在生长、胴体和繁殖性状上优于显性纯合体和隐性纯合体［9］。因此，就目前市场需求来看，单纯地剔除氟烷基因是不利的，应充分利用杂合个体的优势。可以考虑通过合理的选种选配，提高可乐猪群体中杂合个体所占比例，以提高可乐猪的胴体品质，同时避免隐性纯合个体的产生，以控制猪应激综合症导致的劣质猪肉。

［1］KNUDSON C M，MICKELSON J R，LOUIS C F，et al.Distinct immunopeptide maps of the sarcoplasmic reticulum Ca2+release channel in malignant hypethermia［J］.J Biol Chem，1990，265(5):2421－2424.

［2］FUJII J，OTSU K，ZORATO F，et al.Identifaction of muation in porcine ryandine receptor associated with malignant hyperthermia［J］.Science，1991，253:448－451.

［3］STINCKENS A，VAN DEN MAAGDENBERG K，LUYTEN T.The RYR1 g.1843C＞T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3－g.3072G＞A mutation on muscle hypertrophy［J］.Anim Genet，2007，38(1):67－71.

［4］BALATSKIL V N，METLITSKAIA E N.DNA diagnosis of porcine stress syndrome and RYRI genotype association with viability of young pigs［J］.Tsitol Genet，2001，35(3):43－49.

［5］熊远.猪生化及分子遗传试验导论［M］.北京:中国农业出版社，1999:35.

［6］丁能水，黄路生，任军，等.江西省主要外来猪种氟烷基因分布频率的初步研究［J］.江西农业大学学报，1999，21(4):555－557.

［7］刘锐，郁辉.嘉兴黑猪氟烷基因频率检测初报［J］.安徽农业科学，2007，35(18):5442－5442.

［8］朱锋钊，杨春苗，樊翠华，等.七个贵州地方猪种RYR1基因突变的分布［J］.畜牧与兽医，2009，41(4):52－55.

［9］杜晓婷，刘锐，张水明，等.PCR－RFLP 技术检测嘉兴凤桥种猪氟烷基因［J］.安徽农业科学，2009，37(24):11437－11438.