七元瓜环对抗癌药物甲氨蝶呤的溶解性及溶出度的影响研究*

黄 英，马艳辉，王 娟，陶 朱，薛赛凤，祝黔江

(1.贵州大学西南药用生物资源教育部工程研究中心，贵州贵阳550025;2.贵州大学大环化学及超分子化学重点实验室，贵州贵阳550025)

瓜环(Cucurbit［n］urils，Q［n］s)由于其“外亲水，内疏水”的特性［1－2］，作为一种潜在的药物运转、缓释或控释载体，能达到增强药物稳定性、改善药物毒性等功效［3－5］。甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)是一种常见的难溶性抗肿瘤药物，属细胞周期特异性药物，能抑制RNA和DNA的合成，杀伤各期增殖细胞，对多种动物肿瘤有免疫抑制作用，在临床上适用于绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、急性淋巴细胞白血病及急性非淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病的急变期等［6］。本研究组曾报道了八元瓜环可与抗癌药物甲氨蝶呤形成超分子复合物［7］，并探讨了主客体的作用模式及影响条件。但由于八元瓜环在水中的溶解度极差(＜0.01 mM)，限制了其在药物载体方面的应用研究。七元瓜环在水中的溶解度(20～30 mM)与β－环糊精(16 mM)相当［8］，在改善药物稳定性、溶解性等方面有潜在的应用价值。因此，本文研究了七元瓜环(Q［7］)对甲氨蝶呤(MTX)的分子识别作用(其结构见图1)，及其药物质子化形式对主客体作用的影响、作用体系光化学特性的变化等，初步探讨了瓜环对难溶性抗癌药物溶解度及溶出度的影响，为瓜环在抗癌药物载体方面的应用提供理论依据。

图1 七元瓜环及甲氨蝶呤的结构Fig.1 Structures of cucurbit［7］urils and MTX

1 材料与方法

1.1 材料

Agilent 8453型紫外－可见分光光度计(美国Agilent有限公司);HS－3C型pH计(上海济成分析仪器有限公司)。试验中所用七元瓜环(Q［7］)为实验室自制，甲氨蝶呤(MTX)购自Sigma公司，水为二次蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 紫外吸收光谱研究Q［7］与MTX的相互作用 将MTX配制成1×10－3mol/L的溶液，Q［7］配制成2×10－4mol/L的溶液。在4 mol/L HCl溶液、0.01 mol/L HCl溶液及0.1 mol/L NaOH溶液中，测定MTX(20μmol/L)及MTX－Q［7］(20μmol/L MTX+20μmol/L Q［7］)紫外可见吸收光谱。

采用摩尔比法即固定MTX(20μmol/L)的浓度，改变瓜环的浓度，配制一系列不同物质的量之比(NQ［7］/NMTX=0，0.2，0.4，…，3.0)的主客体溶液;采用等摩尔连续变化法溶液，配制成NMTX/NQ［7］+MTX=0，0.1，0.2，0.3，…，1.0一系列溶液，在0.01 mol/L HCl介质中测定体系的紫外吸收光谱。

1.2.21H NMR谱的测定1H NMR谱在20℃下用VARIAN INOVA－400 MHz核磁共振仪测定，氘代水为溶剂。

1.2.3 相溶解度法测定［9］精确称取一定量的MTX分别置于15支不同的试管中，分为3组。每组精确称取Q［7］5、10、15、20、25 mg分别加入不同试管中，加入10 mL不同pH的缓冲溶液。超声30 min，将试管置于25℃的水浴振荡器中振荡2 d，经0.45μm微孔滤膜过滤。滤液用水适当稀释后用紫外分光光度计测定其在最大波长处(304 nm)的吸光度，计算药物含量。以Q［7］含量为横坐标，药物含量为纵坐标，绘制相溶解度曲线。

1.2.4 瓜环对吉非替尼溶出度的影响 采用《中国药典2005版》二部附录溶出度测定法中的第三法小杯测定法［10］，分别精确称取一定量的药物、瓜环与客体包合物(NQ［7］/NMTX=1∶1)置于缓冲溶液中，转速为50 rpm/min，温度为(37±0.5)℃。定时取释放液，同时向释放体系补充相同体积的新鲜介质，以维持释放体系的体积不变。释放液经0.45 μm滤膜过滤，适当稀释后测定其紫外吸收强度A，根据各自的标准曲线计算药物的含量。

2 结果与分析

2.1 Q［7］与MTX相互作用的紫外 －可见光谱分析

MTX存在5个电离平衡［11］，其电离平衡常数(pK)分别为:N(1)，pK1 4.70，α －COOH，pK1 3.36;N(10)，pK1 0.50;N(5)，pK1＜ －1.5。为简化pK值对主客体包结平衡的影响，选择MTX的单离子(MTX+，N(1)质子化，0.01 mol/L HCl)、双离子(MTX2+，N(1)及N(10)双质子化，4 mol/L HCl)及中性存在形式(MTX，0.1 mol/L NaOH)。在上述3种存在形式时，分别对MTX及Q［7］－MTX体系的紫外吸收光谱进行测定，如图2－a、2－b及2－c所示:在MTX2+及MTX存在形式时，加入Q［7］，并未使MTX2+及MTX的紫外吸收光谱发生变化(图2－a及2－c);而在MTX+存在形式下(图2－b)，在 λmax=304 nm处(Q［7］在此波长无吸收)，加入Q［7］，使得MTX+－Q［7］体系的光谱吸收强度减小，吸收峰红移，表明Q［7］与MTX+发生了主客体相互作用。

为进一步了解Q［7］与MTX+相互作用的情况，本文选用摩尔比法及Job法，考察了Q［7］与MTX在0.01 mol/LHCl介质中的相互作用情况(图3、图4)。MTX在304 nm处有最大吸收峰，当加入Q［7］后，体系的紫外吸收强度随着Q［7］浓度的增加而降低，且最大吸收峰从304 nm移到320 nm，红移了10 nm，并且在314 nm和345 nm处出现了两个等吸收点，表明MTX与Q［7］形成了主客体配合物(图3)。从A～NQ［7］/NMTX变化曲线(图4)可以看出，当主客体物质的量之比为2∶1时，吸收强度出现转折点，且随Q［7］浓度的增大吸收强度不再改变，提示主客体之间形成了2∶1的包结配合物。Job法也得到了相同的结果(图4－插图)，其包结平衡常数为:(9.55±0.37)×1011L2·mol－2。

图2 MTX与Q［7］－MTX(1∶1)体系在3种离子形式时的紫外吸收光谱Fig.2 UV-Vis spectra of three ionic forms of MTX and the corresponding Q［7］-MTX system

图3 MTX随着Q［7］浓度增加的紫外可见吸收光谱图Fig.3 Electronic absorption spectra of MTX with the increased concentrations of Q［7］

图4 A～NQ［7］/NMTX曲线Fig.4 A～NQ［7］/NMTX curve

2.2 1 H NMR的测定

图5给出了Q［7］与MTX作用体系的1H NMR谱图。相对于游离MTX来说，加入Q［7］后，复合物中MTX分子中碟啶环上质子H7向高场移动了约1.0 ppm，N10上的甲基质子共振峰H10及苯环上质子共振峰H3’及H5’向高场分别移动了约0.3 ppm及0.1 ppm，H9质子峰隐没入了水峰中，说明MTX分子的碟啶环、甲基及苯环的部分进入了七元瓜环的空腔受到屏蔽作用。同时苯环上质子峰H2’及H6’向低场移动了约0.2 ppm，谷氨酸上α、β及γ基碳上的氢质子共振峰的化学位移均向低场移动，表明MTX的这些部分受到了瓜环端口羰基氧的去屏蔽作用，而Q［7］端口形成了部分包结的主客体包合物。在研究联苯胺在与对称四甲基六元瓜环(TMeQ［6］)作用时，本研究组发现，其作用模式为端口作用，其作用平衡常数达到1010L2·mol－2的数量级［12］。由上述紫外可见吸收光谱数据可知，Q［7］与MTX的主客体作用计量比为2∶1，包结平衡常数为(9.55±0.37)×1011L2·mol－2。结合上述1H NMR作用模式分析，推测Q［7］与MTX的可能作用模式为图5－c。

2.3 Q［7］对MTX溶解度及溶出度的影响

MTX溶解度随pH变化如图6所示。由图6可知，在强酸强碱条件下，MTX的溶解度较大，随着酸度和碱度的降低，MTX的溶解度逐渐降低，在pH 3～9时，溶解度几乎稳定不变。因此，选择pH=3.20、pH=6.50、pH=8.50来研究瓜环对MTX的增溶效应。

采用相溶解度法时，Q［7］对MTX的溶解度影响如图7所示。由图7可知，在3个不同pH条件下，随着Q［7］浓度的增加，MTX的溶解度均逐渐增大;在pH=3.20时，MTX的溶解度增加得最明显;而在pH=6.50及pH=8.20时，MTX的溶解度增加次之。当Q［7］浓度达到6 mM时，在pH=3.20时，MTX的溶解度大约增加了8.5倍，pH=6.50时，MTX的溶解度大约增加了5.6倍;而pH=8.20时，MTX的溶解度大约增加了4倍。上述结果表明，Q［7］对MTX有一定的增溶作用，且Q［7］对MTX的增溶效果受溶液酸碱度的影响。

图5 MTX与Q［7］相互作用的1 H NMR谱图Fig.5 1 H NMR spectra(400 MHz，D20)of interaction between MTX and Q［7］

图6 MTX在不同pH条件下的溶解度曲线Fig.6 The solubility curve of MTX in different pH

图7 在不同pH条件下Q［7］－MTX作用体系的相溶解度图Fig.7 Phase solubility diagrams of the Q［7］-MTX system at different pH

为了探讨Q［7］@MTX超分子体系对药物溶出度的影响，根据《中国药典2005版》二部附录溶出度测定法中的第三法小杯测定法［10］，本文对MTX及Q［7］@MTX包合物的累计溶出度进行了测定，结果见表1。从表1可知，MTX在pH=7.0左右的磷酸缓冲液环境中溶出速度较慢，2 min时累计溶出度为2.45%，随着时间的增加药物溶出度有一定增强，但变化不大，40 min时约溶出9.24%。对于Q［7］@MTX包合物来说，在相同介质中溶出速度较单纯药物MTX明显加快，在2 min时累计溶出度达到63.93%，13 min时可溶出80.56%，然后随着时间的延长累计溶出度几无变化，表明七元瓜环可改善抗癌药物甲氨蝶呤的溶出度。

表1 MTX和Q［7］@MTX包合物累计溶出度Tab.1 The dissolution rate of MTX and Q［7］@MTX inclusion complexes

3 结论

Q［7］与MTX可形成2∶1主客体包结配合物，并且溶液的酸碱度影响主客体的相互作用，1H NMR法进一步证实了Q［7］－MTX主客体配合物的形成。Q［7］可改善MTX的溶解度及溶出度，这将为瓜环作为药物载体的研究提供一定的理论依据。

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