兰索拉唑抑制幽门螺杆菌诱导胃上皮细胞表达COX-2

鲁君艳 张艳 伍海英 李翔 刘胜

幽门螺杆菌(helicobacter pylori，Hp)是外形呈螺旋状的一种微需氧革兰阴性杆菌。是引起慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的重要病因[1－2]。环氧化酶(cyclooxygenase，COX)是催化花生四烯酸形成前列腺素的关键酶。其中，COX-2在生理状态时机体细胞很少表达或表达缺如。当细胞受到诸如炎症、损伤、激素、生长因子、细胞因子、炎症因子、肿瘤诱导剂及紫外线照射等理化因素刺激时，COX-2 迅速合成，表达增加。其产物PGE2作为一种较强的细胞免疫抑制剂，能抑制免疫系统的监管作用，有利于癌细胞的免疫逃逸。同时，PGE2本身还具有抑制胃肠道上皮细胞凋亡和促进其增生的作用。并参与了肿瘤发生、发展的病理生理过程。因此，适当抑制该酶的表达对于治疗Hp相关性胃部疾病应该是有益的[3－4]。兰索拉唑（lansoprazole，LPZ）是由日本武田公司开发的新一代质子泵抑制剂，近年研究显示，LPZ除了具有抗酸作用外，还有一定的抗炎效应[5]。如上调血红素氧合酶1的表达，抑制NF-κB的激活，最终抑制Hp诱导的IL-8产生以及中性粒细胞迁移从而降低炎症反应程度[6]。此外，LPZ也能有效降低吲哚美辛诱导的肠炎[7]。因此，本研究拟采用胃上皮细胞系AGS为研究对象，采用Hp感染后，观察LPZ对COX-2 表达及PGE2产生的影响。

1 资料与方法

1.1 主要实验试剂 COX-2鼠抗人多克隆抗体为Santa Cruz产品, 抗人HRP标记兔抗鼠多克隆抗体购自武汉博士德生物技术有限公司。兰索拉唑购自日本武田药品有限公司（Takeda Pharmaceuticals）。青霉素、链霉素、二甲基亚砜（DMSO）购自华美生物公司。Hp为本研究所保存（ATCC编号：700392）；胃上皮细胞系AGS购自ATCC（编号：CRL-1739）。

1.2 HP的培养及菌液制备 取含Vancomycin(10mg/L)、Amphotericin B(10 mg/L)、Polymyxin B(2500U/L)、TMP(5 mg/L)和 7%脱纤维羊血的哥伦比亚血琼脂平板分区划线，微需氧环境（10% CO2，5% O2，85% N2）37℃，培养 48h。取单菌落进行生化反应、革兰染色和PCR扩增鉴定，确定为阳性后，用灭菌的生理盐水将Hp从血琼脂平板上洗下，然后调整菌液浓度至1×109CFU/mL。

1.3 AGS细胞培养与感染 AGS细胞用含 10%胎牛血清在RPMI-1640 培养基中于5% CO2，37℃下培养。实验分为空白对照组（仅给予0.1% DMSO为对照）、Hp感染组（用100 MOI的Hp感染24h）和不同浓度兰索拉唑组（Hp感染前加入不同浓度兰索拉唑作用3h）。Hp感染结束后，获取细胞用于以下研究

1.4 实时定量PCR检测AGS细胞中COX-2 的表达 细胞处理结束后，根据试剂盒操作说明提取总RNA（FUJIFILM）并逆转录为cDNA，产物用RNA酶处理。设计特异性引物用于检测COX-2表达的定量。其正向引物：5’-ATCTACCCGCCTCACATCCCT-3’ ；反向引物：5’-AGCTGCTCATCATCCCATTCT-3’ 。利用Light-Cycler PCR仪对COX-2 进行扩增：95℃ 10s；60℃ 40s，共35个循环。同时采用β-actin为内参。数据以COX-2/β-actin比值表示。

1.5 Western blot检测AGS细胞中COX-2 表达 6孔板中细胞经PBS漂洗后，加入细胞裂解液裂解30min，4℃ 12000g离心15min，上清即为细胞总蛋白。裂解液中的蛋白用Bradford试剂在分光光度计中测定OD 595处吸光度。50～70μg总蛋白在5%～10%聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并转移至PVDF膜上，经5%无脂牛奶封闭后，分别用孵育一抗，二抗，ECL发光，显影。

1.6 PGE2检测 收集感染后24孔板中细胞上清液，按照ELASA 试剂盒说明书检测PGE2水平。即100μL细胞上清液加入到每个捕获抗体包被的微孔板中，室温孵育2h。洗板后，加入

100μL检测抗体，室温继续孵育2h。随后弃混合物，每孔加入

100μL streptavidin-HRP，室温避光孵育20min。最后，每孔加入100μL底物，室温避光孵育20min，然后加入50μL终止液，分光光度计检测450nm处OD值。

1.7 统计学方法 实验数据采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，组间比较采用t检验，计量资料以均数±标准差（±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 兰索拉唑对Hp感染AGS细胞后COX-2 mRNA表达的影响 实时定量PCR结果显示，Hp未感染前AGS细胞COX-2 表达很低。Hp感染后其mRNA水平显著增高。而AGS细胞预先经30～100μmol/L LPZ处理后，COX-2 mRNA水平有所降低，见图1。

图1 兰索拉唑对Hp感染AGS细胞后COX-2 mRNA表达的影响

2.2 兰索拉唑对Hp感染AGS细胞后COX-2 蛋白表达的影响 Western blot显示，AGS细胞中COX-2 表达很低。Hp感染能使其表达水平增加，而不同浓度LPZ处理后能抑制该效应，见图2。

图2 LPZ对Hp诱导AGS细胞表达COX-2 蛋白的影响

2.3 兰索拉唑对Hp诱导AGS细胞产生PGE2的影响 基础状态下AGS细胞几乎不产生PGE2。100 MOI Hp感染后，PGE2含量达（76±6.5）pg/μg protein。而AGS细胞若用 100μmol/L LPZ预孵育 2h，可显著降低PGE2含量，见图3。

图3 兰索拉唑对Hp诱导AGS细胞产生PGE 2的影响

3 讨论

虽然机体对于Hp感染能够诱导产生较强的细胞与体液免疫应答，但对清除Hp感染依然有限，因此，一旦感染Hp，将长时间维持在持续感染状态。Hp感染引起的炎症反应是Hp的重要致病因素之一。有研究显示，有效控制Hp感染引起的炎症反应能在一定程度上降低消化系统相关疾病的发生。在炎症与癌症的发生过程中，COX-2 在其中起重要作用，COX-2 蛋白的过量表达是胃炎和粘膜损伤的重要机制，也是胃肿瘤发生的早期诊断标志。除了COX-2，PG也与各种胃肠道疾病密切相关。COX-2 在炎症部位被快速诱导表达，产生大量的炎症性PG和其它炎症介导物如细胞因子和蛋白酶类，引起炎症反应。COX-2产生的大量炎症性PG可引起胃黏膜的损伤。PGE2作为一种较强的细胞免疫抑制剂，本身还具有抑制胃肠道上皮细胞凋亡和促进其增生的作用。PGE2刺激bcl-2蛋白表达，bcl-2可抑制细胞凋亡，使细胞增殖和凋亡失衡，从而促进肿瘤发生。由于COX-2 和PG是预防癌症和各种炎性相关疾病的的重要靶点，因此，抑制其过度表达除了能减轻局部炎症反应外，对肿瘤的防治也具有重要的意义[8]。

LPZ是一种第二代质子泵抑制剂。对由组胺、胃泌素和氨甲酰甲基胆碱刺激引起的胃酸分泌均有强力抑制作用，并具有显著的胃蛋白酶分泌抑制作用。此外，LPZ抗菌活性与柠檬酸铋相似，而抗菌力为奥美拉唑的4倍。近年的研究证实，LPZ能抑制小鼠巨噬细胞分泌IL-8、IL-1 β和TNF-α，同时也能抑制ERK 1/2信号通路的活性[9－10]。这表明LPZ除了其固有的抗酸活性外，对机体的免疫系统也可能具有一定的调节作用。迄今为止，有关质子泵抑制剂对Hp感染后胃上皮细胞炎症反应方面的实验还很少，目前尚很难确定其在炎症反应中的作用地位。

本研究证明，LPZ能在蛋白和mRNA水平抑制Hp感染后胃上皮细胞表达COX-2 并产生PG。由于Hp感染诱导的COX-2 的过度表达是胃癌和各种炎性疾病发生的重要因素，因此，LPZ对治疗带来的临床益处可能远超出其抗酸作用所产生的效果，它在抗酸分泌的同时能有效改善Hp感染后的炎症反应，最终发挥胃黏膜保护作用。因此，我们可通过该效应抑制COX-2表达或减低此酶的活性来抑制大量PG的产生，从而治疗Hp相关性胃黏膜疾病。

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