葛根素对慢性乙醇中毒小鼠胃窦黏膜胃泌素、生长抑素表达的影响

夏白娟，崔淑芹

(1贵阳医学院组织胚胎教研室，贵阳550004;2德州学院医学系)

目前，乙醇性胃肠道疾病的发病率呈逐年增加趋势。葛根素作为解酒药［1～3］，其对乙醇性肝损伤、股骨头坏死等疾病的干预作用也有不少报道［4～6］。2013年2～7月，我们通过观察葛根素对慢性乙醇中毒模型大鼠胃窦黏膜胃泌素(Gas)、生长抑素(SS)表达的影响，探讨葛根素对慢性乙醇中毒的可能治疗作用。

1 材料与方法

1．1 材料 2%的注射用葛根素(山东瑞阳制药有限公司生产);乙醇为56%的红星二锅头(北京怀柔红星股份有限公司)。生后6周雄性BALB/C小鼠24只(首都医科大学动物部提供)，体质量为22～26 g。

1．2 方法

1．2．1 模型制作 雄性健康BALB/C小鼠24只，适应性饲养1周，自由进食。室内温度恒定在 (22±2)℃，相对湿度为60% ～65%，每天12 h的亮/暗循环。随机分为生理盐水对照组(SC组)、慢性乙醇中毒组(CAI组)和葛根素干预组(PUE组)，每组8只。CAI组和PUE组用56%乙醇进行灌胃:第1周剂量为6 mL/kg，第2周和第3周为12 mL/kg，第4周为15 mL/kg进行灌胃，每天1次灌胃(上午9∶00)，前两周每天给予体积数为0．1的乙醇随意饮用，后两周每天给予体积数为0．2的乙醇随意饮用。SC组给予相当剂量的生理盐水进行灌胃。PUE组在给予乙醇灌胃的同时按照葛根素1 mg/10 g的剂量行腹腔注射。SC组、CAI组小鼠用与PUE组葛根素相当体积的生理盐水进行腹腔注射，为期4周。

1．2．2 取材和标本制备 于末次给药当晚禁食，自由饮水，24 h后断头处死小鼠，取胃窦组织，置于Bouin液内再固定。常规石蜡包埋，制成4μm厚的连续切片。

1．2．3 Gas、SS表达检测 免疫组织化学单染法每例观察切片5张以上，切片间隔56μm。主要步骤:切片常规脱蜡至水，室温下10%甲醇H2O2处理10 min，正常羊血清(1∶50)室温下封闭30 min。分别滴加一抗(兔抗Gas血清，工作浓度1∶100;兔抗SS血清，工作浓度1∶100，武汉博士德生物工程公司)，4℃孵育过夜，羊抗兔IgG(1∶100博士得生物工程公司)37℃孵育20 min，SABC复合物(1∶100)37℃孵育20 min，DAB-H2O2液显色，苏木精轻度复染细胞核，中性树胶封片。对照研究方法:PBS缓冲液代替特异性抗血清作为阴性对照，余步骤相同。随机选取各组小鼠胃窦切片5张，应用BioMias图像分析系统进行检测。在40倍物镜下，每张切片随机选取5个视野，分别计数每个视野内的Gas和SS阳性细胞数并测其平均灰度值。

1．2．4 统计学方法 应用SPSS11．5统计分析软件对所得的数据进行统计分析。数据以¯x±s表示，组间比较用单因素方差分析。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 胃窦Gas阳性细胞表达 光镜下观察，小鼠胃窦的Gas免疫反应产物呈棕黄色细颗粒状，位于细胞质内，细胞核淡蓝色;对照切片未见免疫反应阳性细胞。Gas阳性细胞存在于幽门腺，散在于上皮细胞间。呈点状分布成条带样，与胃黏膜表面平行。细胞呈锥体形、梭形、圆形、椭圆形或不规则形，有的细胞发出细长突起直达腺腔或伸向邻近细胞。各组Gas阳性细胞的分布及形态大致相同，免疫染色强度无明显差异。图像分析结果显示:PUE组Gas阳性细胞数量比CAI组明显减少(P＜0．05)，和SC组相比无统计学差异(P＞0．05);三组Gas阳性细胞平均灰度值差异无统计学意义(P＞0．05)。见表1、图1。

2．2 胃窦SS阳性细胞表达 光镜下见小鼠胃窦SS阳性细胞形态多样，呈卵圆形、梭形或不规则形，有的细胞可见突起，细且长，主要分布于腺上皮之间，免疫产物呈棕黄色或棕黑色，定位于胞质内。三组胃窦内的SS阳性细胞在分布及形态上无明显差异。与CAI组比较，PUE组和SC组内的SS阳性细胞数量增多，且免疫染色强度增强，平均灰度值降低，差异具有统计学意义(P均＜0．05)。PUE组阳性细胞数量和平均灰度值与SC组之间差异无统计学意义(P ＞0．05)。见表1、图1。

表1 各组胃窦Gas、SS阳性细胞计数(个/视野，¯x±s)

图1 各组胃窦黏膜Gas、SS阳性细胞平均灰度值

3 讨论

乙醇是影响全身的毒性物质，对机体神经内分泌系统有极大的影响［7］。乙醇经口摄入后，可直接破坏胃的黏膜黏液屏障，使胃黏膜受损，引起胃黏膜充血、糜烂、出血，甚至浅表性溃疡等，是一种常见的黏膜致死物质。长期高浓度摄入乙醇对胃肠道内分泌系统也有影响。

Gas是研究最早、最多的多肽激素，主要由胃窦和小肠黏膜的G细胞分泌。Gas素通过直接刺激壁细胞的Gas受体而刺激壁细胞分泌胃酸，也间接通过类肠嗜铬细胞(ECL细胞)的Gas受体刺激ECL细胞释放组胺，再以旁分泌方式激活壁细胞H受体而使之泌酸［8］;Gas还能增加胃肠道的运动［9，10］，使胃、肠、胆囊的收缩作用加强;并且Gas还是一种免疫调节肽，能参与调控多种炎症因子［11］，对维持胃黏膜完整性有一定的作用。

本实验中，CAI组小鼠胃窦黏膜Gas阳性细胞数量明显增加，提示在乙醇毒性作用下，胃窦黏膜Gas分泌过多，一方面促进了胃酸的分泌，使黏膜屏障进一步破坏，引起黏膜充血、出血、糜烂等表现;另一方面Gas促进胃肠平滑肌的收缩，促进胃肠蠕动，加速转运，引起腹泻等症状。

SS是一种典型的脑肠肽，广泛分布于脑、胰、肠道神经细胞和胃黏膜内，由D细胞分泌。胃肠内分泌细胞大多属于开放型，通过直接感受胃肠腔内化学物质浓度的变化，而使其合成和分泌受到影响。SS对体内许多生物活性物质的分泌具有抑制作用，在胃肠道可以直接作用于 G细胞抑制Gas的分泌［12］，影响血管活性肠肽、肠促胰酶肽等其他胃肠激素释放。此外，还能抑制胃肠道运动及抑制细胞增殖［13，14］，还可能通过保护谷胱甘肽还原酶活性以维持胃黏膜内非蛋白结合疏基含量，从而防止细胞膜脂质过氧化，保护胃黏膜。近年来，SS及其类似物在临床广泛应用，不仅可以用于内分泌肿瘤的治疗，而且对胃肠道肿瘤及胃肠出血等疾病都有较好的治疗效果，是胃黏膜细胞和胃肠黏膜屏障重要的保护性因素［15］。

在本实验中，CAI组胃窦黏膜中SS阳性细胞数量较SC组减少，这与谢勇等［16］的报道一致。表明乙醇可破坏D细胞或抑制SS的分泌。SS水平削弱了其对胃泌素和胃酸分泌的抑制作用，以及对上皮细胞和黏膜的保护作用，加重胃黏膜的损伤。

葛根为常用中药，是豆科植物野葛或干葛藤的干燥根，始载于神农本草经，被列为中品，有山人参的美称;葛根性平，味甘辛，具有发表解肌、开阳透疹、解热生津等作用。葛根解酒主要是因为葛根含有乙醛脱氢酶成分，可用于治疗乙醇依赖和乙醇戒断症状［17］。乙醇中毒或酗酒的治疗主要是通过乙醛脱氢酶抑制剂产生一定的乙醛，造成人体不适而减少乙醇的摄入或戒酒。Benlhabib等［18，19］研究发现，葛根所含主要物质葛根素、大豆苷、大豆苷元等异黄酮成分可明显抑制乙醇喜爱型大鼠的乙醇摄入和减轻戒断症状。目前临床使用的葛根素是从葛根中提取分离出来的一种单体，属异黄酮类化合物，具有抗缺血再灌注损伤、保护神经细胞等多种药理作用，适用于治疗冠心病、心绞痛、心肌梗死等疾病［20］。王福文等［21］研究发现，葛根素可以明显减轻浸水应激所引起的大鼠胃黏膜损伤。本研究发现，通过预先进行葛根素处理后再行乙醇灌胃的小鼠，其胃窦黏膜内的Gas、SS阳性细胞的数量较CAI组有明显改变，SS阳性细胞水平接近于SC组，SS分泌增加，激活其对机体的保护功能，从而抑制Gas阳性细胞的增殖和胃酸的分泌。本研究提示，葛根素通过引起乙醇性胃黏膜损伤时Gas、SS表达的改变，参与乙醇对胃窦黏膜产生损伤的调节，对乙醇性胃黏膜损伤有保护作用。

［1］马晓雨．酒精与多器官损害［J］．青海医学院学报，2001，22(1):52-53．

［2］毛英群，刘高仁，李颖．葛根素注射液治疗重度急性酒精中毒30 例［J］．中医研究，2011，24(6):41-43．

［3］Penetar DM，Maclean RR．Kudzu extract treatment does not increase the intoxicating effects of acute alcohol in human volunteers［J］．Alcohol Clin Exp Res，2011，35(4):726-734．

［4］崔国元，李铁刚，张顺．葛根素对慢性酒精中毒小鼠肝脏的保护作用［J］．实用药物与临床，2009，12(5):314-315．

［5］王义生，李月白，殷力，等．葛根素预防酒精性股骨头坏死的实验研究［J］．河南医学研究，2007，16(4):289-297．

［6］崔淑芹．葛根素对急慢性酒精中毒大鼠心脏的保护性调控作用［J］．南方医科大学学报，2011，31(12):2035-2038

［7］杨晓明，崔慧先．酒精对神经及内分泌系统作用的研究进展［J］．白求恩军医学院学报，2003，1(1):48-50．

［8］范玉林，杨建民，罗元辉，等．慢性萎缩性胃炎患者幽门螺杆菌根除后胃黏膜G细胞数量和血清胃泌素含量的变化［J］．胃肠病学，2005，10(2):93-96

［9］Adamu MA，Weck MN，Gao L，et al．Incidence of chronic atrophic gastritis:systematic review and meta-analysis of follow-up studies［J］．Eur J Epidemiol，2010，25(7):439-448．

［10］张忠，孙丽萍，宫月华，等．胃黏膜癌变过程中血清胃泌素水平的变化及其影响因素的研究［J］．中国实用内科杂志，2006，26(23):1878-1880．

［11］Calatayud S，Alvarez A，Víctor VM．Gastrin:an acid-releasing，proliferative and immunomodulatorypeptide［J］．Mini-Rev Med Chem，2010，10(1):8-19．

［12］Schubert ML．Gastric exocrine and endocrine secretion［J］．Curr Oponon Gastroenterol，2009，25(6):529-536．

［13］Panteris V，Karamanolis DG．The puzzle of somatostatin:action，receptors，analogues and therapy［J］．Hepatogastroenterology，2005，52(66):1771-1781．

［14］Corleto VD．Somatostatin and the gastrointestinal tract［J］．Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes，2010，17(1):63-68．

［15］ Pawlikowski M，Melen-Mucha G．Perspectives of new potential therapeutic applications of somatostatin analogs［J］．Neuro Endocrinol Lett，2003，24(1-2):21-27．

［16］谢勇，黄德强，周小江，等．功能性便秘患者乙状结肠黏膜内胃肠激素及一氧化氮的变化［J］．现代消化及介入诊疗，2004，9(1):9-10．

［17］曾明，邸晓辉．葛根及葛花对酒精代谢的研究［J］．医药论坛杂志，2010，31(23):203-205．

［18］Benlhabib E，Baker JI，Keyler DE，et al．Effects of purified puerarin on voluntary alcohol intake and alcohol withdrawal symptoms in P rats receiving free access to water and alcohol［J］．JMed Food，2004，7(2):180-186．

［19］Lukas SE，PenetarD，Berko J，et al．An extract of the Chinese herbal root kudzu reduces alcohol drinking by heavy drinkers in a naturalistic setting［J］．Alcohol Clin Exp Res，2005，29(5):756-762．

［20］韩春妍．葛根素治疗相关疾病的研究［J］．实用药物与临床，2012，15(3):178-180．

［21］王福文，李杰，胡志力，等．葛根素对大鼠应激性胃黏膜损伤的保护作用［J］．中国中药杂志，2006，31(6):504-506．