白血病干细胞和骨髓基质细胞共培养的方法学探讨

冯锡武，罗政委，魏 虹，农卫霞，周宗瑶

(1石河子大学医学院组织胚胎学教研室，新疆石河子832000;2石河子大学医学院附属医院)

白血病是一类造血干细胞异常的恶性克隆性疾病，骨髓移植及造血干细胞的临床应用促进了白血病及白血病干细胞(LSCs)的研究进展。自从Bonnet等［1］确认 LSCs 存在于细胞群以后，LSCs的研究进入了新的阶段［2～4］等

陆续被证实是LSCs的表型，白血病造血干细胞移植也取得了越来越显著的成就。尽管如此，造血干细

cell culture胞的体外培养扩增方面仍然面临很多困难。2011年12月～2013年2月，我们对LSCs和骨髓基质细胞共培养的方法学进行了探讨。

1 材料与方法

1．1 材料 倒置相差显微镜(OLYMPUS公司)，CO2培养箱(Thermo公司)，流式细胞仪(BD AriaIII)，超净工作台(Thermo公司)，L-DMEM培养基(Gibco公司)，RPMI-1640培养基(Gibco公司)，胎牛血清(FBS)(杭州四季青公司)，CD34-APC、CD38-FITC、CD123-PE荧光标记抗体(Ebioscience公司)，注射用丝裂霉素(浙江海正药业股份有限公司)，淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)，6/24孔培养板(Corning公司)。

1．2 方法

1．2．1 骨髓单个核细胞的分离和培养 采用人淋巴细胞分离液密度梯度离心法获取白血病患者骨髓单个核细胞，离心后离心管中液体明显分为4～5层:红细胞层、淋巴细胞分离液层、单个核细胞云雾状层、血浆同稀释液层(或者脂肪层)。提取单个核细胞云雾状层，离心洗涤后加入含有10%FBS的RPMI-1640中吹打成单细胞悬液，调整细胞浓度106/mL，转入培养瓶或者培养板中培养。3 d后换液，将悬浮细胞分开培养或冻存。

1．2．2 饲养层细胞的制备及共培养 将第2代或第3代骨髓基质细胞接种到24孔培养板中，待基质细胞达到80%融合度时，弃培养基，换用10μg/mL的丝裂霉素培养基培养2～3 h，然后用PBS冲洗3～5次，尽量减少丝裂霉素对后续共培养的影响，添加新鲜培养基并将悬浮造血细胞转入共培养。原代共培养的基质细胞不做任何处理，持续共培养。

1．2．3 细胞表面抗原标志检测 采用流式细胞仪，收集1×106以上细胞，PBS洗涤2次，分为5管，每管不少于200μL，密度不低于5×105/mL。一管不加荧光抗体作为阴性对照，三管分别加入不同标记的荧光抗体作为单阳对照，一管加入全部三种荧光抗体作为检测管。4℃放置30 min，洗涤重悬后转入流式管中，上机检测。

2 结果

图1 LSCs的表面标记

2．2 基质细胞同白血病细胞共培养结果 增殖的细胞在一起排列生长成细胞群(见图2)。图中箭头所示为卵石样区域细胞。具有自我更新能力的干细胞同基质细胞黏附在一起，折光性变弱;有一部分干细胞会通过基质细胞之间的缝隙进入基质细胞层的下面［5］，找寻维持其干性的微环境。

图2 基质细胞同造血系统LSCs共培养镜像

3 讨论

干细胞的生存必须依赖其周围的祖细胞、淋巴、巨噬、成纤维、内皮和其他各类间充质细胞分化构成的微环境。CD+34细胞中95%以上是早期和晚期造血祖细胞，干细胞只是很小一部分［6］，这说明了真正的干细胞比例是极其低的。

不论是正常造血干/祖细胞还是白血病干/祖细胞，它们的体外扩增都是一个世界性难题。体外培养条件下，扩增非常有限。骨髓基质细胞可以支持造血系细胞的增殖现在是一种共识，LSCs虽然是异常的造血系细胞，但是也离不开基质细胞等所营造的微环境。上世纪90年代，科学家找到一系列细胞因子，如 SCF、FL、TPO、IL-6 和 IL-3，并发现这些细胞因子似乎可以促使造血干细胞在体外大量扩增，但后来的实验研究证明，这些因子的主要作用是诱导造血干细胞分化成造血祖细胞，并最终分化成各类成熟的血细胞。也有研究显示，SCF、FL、IL-3对LSCs的扩增是无效的。

骨髓间充质干细胞(MSCs)可以分化成多种基质细胞(BMSC)，然而通常情况下，因为无法确切地将两者进行区分，往往认为它们代表了同一概念。但是，基质细胞所涵盖的范围要远远大于间充质干细胞。

裴雪涛［8］研究结果显示，体外培养的BMSC表达 IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、LIF、MCSF、Flt-3 配基和 SCF 的 mRNA。朱光荣等［9～10］也证实TPO表达于MSCs。将CD+34造血干/祖细胞分别与骨髓MSC和BMSC共培养后发现，BMSC能够更有效地支持造血干/祖细胞的分化［11］。此外，细胞外基质在造血细胞扩增及LTC-IC的维持中也起着重要的作用［12］。本结果同上述研究基本一致。丝裂霉素处理的传代骨髓基质细胞，不能够再增殖、分化，只能够短暂地分泌一些细胞因子。而未经处理的原代骨髓基质细胞，很好地保存了骨髓中的各种贴壁性细胞并能够分泌更多种类的细胞因子;长期培养的基质细胞分泌的基质也可以结合一些细胞因子或生长因子，从而营造更接近体内的造血微环境。虽然不能通过细胞表面标记简单地将LSCs同造血干细胞明确一分为二，但是在超出正常水平细胞量的情况下，可以认为检测到的干/祖细胞中绝大部分是白血病干/祖细胞。

本研究显示，部分白血病细胞在原代共培养中能够长期存活，并且不间断地有细胞团的产生，表明原代共培养可以更好地扩增 LSCs。这些研究为LSCs的培养找到了一种经济可行的方法，也为进一步研究LSCs提供了宝贵经验。

［1］Bonnet D，Dick JE．Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell［J］．Nat Med，1997，3(7):730-737．

［2］Jordan CT，Upchurch D，Szilvassy SJ，et al．The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells［J］．Leukemia，2000，14(10):1777-1784．

［3］Hosen N，Park CY，Tatsumi N，et al．CD96is a leukemic stem cell-specific marker in human acute myeloid leukemia［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(26):11008-11013．

［4］肖平，曾耀英，林蔚．白血病干细胞相关抗原在急性白血病细胞中的表达［J］．中华实用诊断与治疗杂志，2011，25(12):1179-1181．

［5］Jing D，Fonseca AV，Alakel N．et al．Hematopoietic stem cells in co-culture with mesenchymal stromal cells-modeling the niche compartments in vitro［J］．Haematologica，2010，95(4):542-550．

［6］唐佩弦．干细胞基础研究进展［J］．医学研究杂志，2007，36(6):4-8．

［7］Jordan CT，Upchurch D，Szilvassy SJ．et al．The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells［J］．Leukemia，2000，14(10):1777-1784．

［8］裴雪涛．干细胞技术［M］．北京:化学工业杂志社，2002:37-38．

［9］朱光荣，周小玉，陆化，等．人骨髓间充质干细胞表达多种造血细胞因子［J］．中国实验血液学杂志，2003，11(2):115-119．

［10］Jang YK，Jung DH，Jang MH，et al．Mesenchymal stem cells feeder layer from human umbilical cord blood for vivo expanded growth and proliferation of hematopoietic progenitor cells［J］．Ann Hematol，2006，85(4):212-225．

［11］韩忠朝．间充质干细胞基础及临床［M］．北京:科学出版社，2012:249-250．

［12］郝玉书，肖志坚．白细胞疾病基础理论与临床［M］．上海:上海科学技术出版社，2006:4-6．