人IL-12/慢病毒重组体对结肠癌干细胞“干性”的影响①

尹晓玲 王正中 赵银晶 陈华俊 杨晓琼 梁后杰 (重钢总医院肿瘤科，重庆 400081)

结肠癌是常见恶性肿瘤之一，发病率呈逐渐上升趋势，目前虽有手术、化疗、生物治疗等常规手段，但结肠癌总生存率并未提高。许多研究表明，肿瘤细胞群中有小部分特殊细胞即癌症干细胞(Cancer stem cell，CSCs)的存在，且CSCs与肿瘤发生、侵袭、转移和对传统治疗是否敏感密切相关［1，2］。越来越多的证据支持结肠 CSCs的存在［3，4］，并且可能是肿瘤转移及复发的主要原因。

众所周知，大多数传统治疗方法不能靶向CSCs。我们前期研究发现，小鼠IL-12重组质粒转染小鼠Lewis肺癌细胞后进行瘤内注射可产生明显的抗瘤免疫作用［5，6］，相关研究支持细胞因子对CSCs同样具有作用，因此我们推测IL-12对CSCs可能同样有作用［7］。我们前期试验证实 CD133+CD44+结肠CSCs如SW480细胞上清液不能测到IL-12，说明CD133+CD44+结肠CSCs不表达或低表达IL-12。IL-12是主要由抗原递呈细胞(APC)如单核细胞产生的细胞因子［8］，人IL-12对肾癌、皮肤T细胞淋巴瘤、黑色素瘤及卵巢癌腹膜转移的患者均有不同程度的临床效应［9-14］，瘤内注射 Ad．IL-12(腺病毒IL-12)可行并且安全［15］。

基于这些结果，我们推测构建 IL-12过表达CSCs模型将有效抑制CSCs生存及肿瘤生长。本研究利用高效转染的慢病毒作为载体构建IL-12过表达质粒，将其转染结肠 CSCs，RT-PCR及 Western blot观察其在结肠CSCs表达及对其“干性”的(自我更新及分化)影响，为进一步进行动物实验打下基础。

1 材料与方法

1．1 主要试剂 细胞培养液DMEM/F12及DMEM(高糖)、胎牛血清、重组表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF-2)均购于Gibco公司。含绿色荧光蛋白GFP的慢病毒载体表达质粒(pGCFU)购于Genechem公司;pORF-hIL-12 G2质粒购于InvivoGen公司;CCK-8试剂盒购于江苏碧云天公司;胰酶、DEPC、Tris碱、EDTA均购于 Sigma公司;抗人CD133/PE抗体及抗人CD44/APC抗体购于BD Pharmingen公司;BCA蛋白定量试剂盒购于Thermo Fisher Scientific;限制性内切酶(HindⅢ及EcoRⅠ)购于NEB公司产品;DL-2000 DNA分子量标准品购于TaKaRa生物公司;总RNA提取试剂盒购于上海生工;质粒抽提试剂盒购于Promega公司，Taq聚合酶购于Genotech公司。

1．2 细胞培养 结肠癌细胞株SW480由本教研室传代保存，干细胞条件培养基(不含胎牛血清的DMEM/F12培养基，含20 ng/ml EGF、20 ng/ml bFGF-2、1×B27和1% 青链霉素)筛选培养2周后，流式细胞仪分选出CD133+CD44+SW480细胞。

1．3 结肠癌CSC的筛选及鉴定 结肠癌细胞条件培养及流式细胞仪分选结肠癌干细胞:结肠癌SW480细胞(购于ATCC)接种于低吸附96孔板(200个细胞/孔)，在干细胞条件培养基中培养2周，筛选出未分化肿瘤细胞，慢慢增殖，形成细胞团块，即“肿瘤球”。继续培养1～2周，反复吹打使原始球解聚，移至培养板中再培养增殖。细胞分四组:①分别加入10μl PE(Phycoerythrim，藻红蛋白)标记的小鼠抗人CD133单克隆抗体及APC(Allophycocyanin，别藻青蛋白)标记的小鼠抗人CD44单克隆抗体;②加入10μl PE标记的小鼠抗人CD133单克隆抗体;③加入10μl APC标记的小鼠抗人CD44单克隆抗体;④加10μl PBS作为空白对照。充分混合，4℃暗处孵育20分钟。洗涤，离心，重悬细胞上机分选。

富集CD133+CD44+细胞作为结肠CSCs，分选出的CSCs用干细胞培养基培养于37℃、5%CO2孵箱中。

1．3．1 CD133+CD44+SW480细胞增殖实验 将分选得到的CD133+CD44+SW480及CD133－CD44－SW480细胞制成单细胞悬液，调细胞浓度至5×104m l－1，分别接种于6 块96 孔板中，0．1 ml/每孔，3 复孔，另设空白对照孔调零，5%CO2、37℃培养。分别在0、1、2、3、4和 5天随机选取1个96孔板，每孔加入10μl的CCK-8试剂，置于培养箱继续培养4小时。酶标仪测定450 nm波长处各吸光度值(A450)，取各时间点细胞吸光度的平均值，以时间(d)为横坐标，A450为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1．3．2 CD133+CD44+SW480 细胞克隆形成能力调整 CD133+CD44+SW480细胞和 CD133－CD44－SW480细胞浓度至1×104ml－1。接种于6孔板中，5%CO2，37℃培养2～3周。当6孔板中出现肉眼可见的克隆时终止培养。弃去培养液，用PBS液浸洗3次。加入5 ml甲醇固定15分钟，姬姆萨染液染色10分钟，倒置显微镜观察并计数克隆数。

1．3．3 CD133+CD44+SW480 及 CD133－CD44－SW480细胞无血清培养成球能力 调整CD133+CD44+SW480细胞和CD133－CD44－SW480细胞浓度。各取10 000个两组细胞分别加入6孔板中，5%CO2，37℃培养。隔日换液1次。显微镜下观察细胞生长，7天后终止培养。

1．3．4 NOD/SCID体内成瘤能力 雌性 NOD/SCID鼠15只(n=5)，5～6周龄，体重25～30 g，饲养在无特定病原体(Specific pathogen-free，SPF)级的洁净层流架内。分别将CD133+CD44+SW480细胞和CD133－CD44－SW480细胞制成单细胞悬液。常规消毒皮肤，按 100/只、1 000/只、10 000/只接种到裸鼠双侧前肢背部皮下。接种后每周两次观察小鼠，6周后处死小鼠，统计不同亚群细胞的成瘤情况。

1．4 构建IL-12慢病毒表达载体 构建重组IL-12p70慢病毒质粒:根据Genbank中人IL-12 cDNA序列(IL12A GeneID:3592，IL12B GeneID:3593)设计PCR引物，引物含同源重组序列、HindⅢ及EcoRⅠ酶切位点。上游引物为:5'TCCCCCGGGCCACCATGGGTCACCAGCA 3'，下游引物为:5'ACCG-GAGCTCTTAGGAAGCATTCAGATAG 3'。用 E．coli Fast-Media®Amp培养基(液)扩增含 pORF-hIL-12 G2质粒的E．coli菌，抽提质粒 DNA，以 pORF-h IL-12 G2质粒为模板通过PCR扩增IL-12p70。

PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收后通过双酶切，将IL-12p70 DNA片段与pGC-FU载体连接，将IL-12p70基因片段交换插入pGC-FU，获得重组质粒 pGC-FU-IL-12。同时以pGC-FU-GFP-LV病毒为阴性对照。

菌落PCR鉴定转化子，阳性克隆送华大基因测序，测序正确的克隆摇菌扩大培养，用除内毒素DNA抽提试剂盒提取质粒DNA，用于病毒包装，并进行IL-12慢病毒过表达载体的滴度检测。

1．5 重组肿瘤干细胞模型的建立以及鉴定 IL-12过表达慢病毒质粒转染结肠CSCs:转染前一天，取生长状态良好的CD133+CD44+SW480细胞，调整细胞浓度，用不含抗生素的干细胞培养基接种细胞到24孔板，5×104细胞/孔。分组:①未转染细胞组;②IL-12过表达慢病毒载体转染细胞组;③空载体转染细胞组。在EP管里分别加入50μl Opti-MEM Ⅰ Reduced Serum Medium 和0．8μg IL-12过表达慢病毒载体DNA，轻柔混匀，制成DNA稀释液。在另一个EP管里分别加入50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium 和 2．0 μl TransLipid，制成TransLipid稀释液，室温静置5分钟。将两种稀释液轻柔混合，室温静置20分钟，形成DNA-TransLipid复合物。将该复合物加入到接种好的细胞中，37℃，5%CO2培养6小时后更换培养基继续培养18小时。在转染24小时后将细胞按照1∶10的比例接种到新鲜培养基中，第二天加入选择性培养基进行筛选。稳定转染细胞称作慢病毒-IL-12。转染72小时后，收集培养上清液，离心去除细胞碎片，然后将上清用0．45μm的PVDF滤膜过滤，RT-PCR和 Western blot检测培养上清液IL-12表达。

1．5．1 RT-PCR检测细胞上清液IL-12基因表达按说明书抽提细胞培养上清总RNA，室温干燥5～10分钟至RNA呈半透明状，加入30μl DEPC处理过的水溶解，变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性。抽取的RNA经逆转录后用于PCR扩增。RTPCR扩增产物用1%琼脂糖电泳分析。

1．5．2 Western blot检测细胞上清液IL-12蛋白表达 用蛋白抽提试剂盒-Ⅱ提取，浓缩上清至原体积的1/30～1/10，即为细胞上清液总蛋白。蛋白样品按照1∶4的比例加入5×上样缓冲溶液，100℃变性5分钟，BCA法测蛋白浓度，SDS-PAGE垂直电泳，电转膜，抗原-抗体反应，化学发光法显色，通过在BIO-RAD凝胶成像分析系统上进行扫描及图像分析。用相对灰度值表示蛋白相对含量。

1．6 IL-12 对结肠 CSCs“干性”的影响

1．6．1 IL-12对结肠CSCs克隆形成能力的影响将转染 IL-12过表达慢病毒质粒及未转染的CD133+/CD44+SW480细胞计数后，调整细胞浓度。各取10 000个两组细胞分别加入6孔板中，加入适量条件培养基，5%CO2，37℃培养。每隔1天半量换液1次。显微镜下观察细胞生长情况，7天后终止培养。

1．6．2 IL-12对结肠CSCs分化的影响 为了观察IL-12对结肠CSCs的体外分化能力的影响，我们取转染IL-12过表达慢病毒质粒的细胞及未转染的CD133+CD44+SW480在条件培养基中形成的克隆细胞球，移入含10%胎牛血清培养基中连续观察其生长情况，1周后用SP免疫组化试剂盒检测两组细胞CK20表达(结果判断:被测细胞胞浆染色黄-棕色为阳性表达)，同时流式细胞仪检测两组细胞中CD133+CD44+SW480比例。

2 结果

2．1 流式细胞仪分选出CD133+CD44+SW480细胞 经条件培养的SW480细胞含有(90．8±4．5)%CD133+CD44+细胞(图1A)，并能形成典型的“神经球”结构，而 PBS空白对照组只有(1．2±0．3)%CD133+CD44+细胞(图 1B)，皮下接种 100个CD133+CD44+SW480细胞和CD133－CD44－SW480细胞均不能成瘤;接种1 000个/只CD133+CD44+小鼠中有2只成瘤，接种 10 000个/只 CD133+CD44+小鼠均能在2周内成瘤，而1 000个/只及10 000个/只CD133－CD44－在6周内均不能成瘤。因此我们推测SW480细胞株中存在干细胞。

CD133+CD44+SW480细胞于条件培养基中培养，细胞呈悬浮生长，单细胞、圆形、透亮。培养3天后，细胞成球形悬浮生长(图2A)。到第7天时形成较大的肿瘤细胞球，形态大小各异，而且较前致密(图2B)。将悬浮细胞球移入含10%胎牛血清的DMEM/F12的培养基中，常规培养4小时后，细胞变为梭形，少部分开始贴壁生长;24小时后完全贴壁生长(图2C)。CD133－/CD44－SW480培养2周均不能形成细胞球(图2D)。与 CD133－CD44－SW480相比，CD133+CD44+SW480有更强的增殖能力，至第5天，细胞增殖明显，曲线变陡直，而CD133－CD44－SW480曲线较平坦。对各时间点A450进行比较，结果表明两组细胞间差异具有统计学意义(图2E)。克隆形成实验显示:培养3周后，CD133+CD44+SW480形成的细胞克隆数为271．22 ±57，而 CD133－/CD44－SW480 为 22．24 ±6．56。提示CD133+CD44+SW480具有更强的克隆形成能力，差异具有统计学意义(P＜0．05，图2F)。

图1 流式细胞仪分选CD133+CD44+SW 480结肠癌干细胞Fig．1 CD133+/CD44+SW 480 colon CSCs was sorted by flow cytometry

图2 CD133－CD44－SW 480及CD133+CD44+SW 480在不同培养基中增殖克隆Fig．2 CD133－CD44－ SW 480 and CD133+CD44+SW 480 proliferated in differentmedium

2．2 慢病毒-IL-12表达质粒构建成功并抑制CD133+CD44+SW480自我更新 IL-12基因及慢病毒载体通过双酶切及连接，成功构建慢病毒-IL-12表达质粒。转化感受态大肠杆菌后挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定，胶回收得到长约1 700 bp的目的基因片段。重组质粒测序结果显示，重组质粒中的目的片段与Genebank中的序列符合，证实IL-12基因已成功克隆到慢病毒载体。以上结果证实慢病毒-IL-12表达质粒构建成功。

将293T细胞包装病毒24小时后，荧光显微镜下可见细胞内大小不等的绿色荧光颗粒，细胞生长状态良好(图3B)，收获病毒并浓缩，对包装病毒滴度进行检测，IL-12慢病毒平均滴度3．5×108ml－1，结果表明成功的进行了慢病毒-IL-12的包装，可以进行下一步实验。

RT-PCR和 Western blot检测表明，将慢病毒-IL-12或空载体(空白对照)转染CD133+CD44+SW480，慢病毒-IL-12上清液表达 IL-12 mRNA(图3C)和蛋白(图3D)，但空白对照无表达，而结肠细胞WM35上清也表达IL-12 mRNA和蛋白，但表达水平明显低于慢病毒-IL-12。将CSCs悬浮于无血清的CSCs培养液中，肿瘤球形成后光学显微镜观察肿瘤球数量。值得注意的是，转染IL-12/慢病毒重组体的CSCs不能形成明显的肿瘤球(说明增殖率降低)(图3E)。而未转染IL-12/慢病毒重组体的CSCs形成表型和结构上和初代基本相同的克隆球(图3F)。结果显示IL-12降低了结肠CSCs自我更新能力。

2．3 IL-2对结肠CSCs分化的影响 为了观察IL-12对结肠CSCs体外分化能力的影响，转染后1周，我们分别将转染及未转染IL-12-慢性毒重组体的CSCs移入含10%小牛血清培养基中连续观察其生长情况，我们发现:克隆细胞球于接种后24小时贴壁生长，随后的几天有分化的贴壁细胞从细胞球中游出，并逐渐形成成片贴壁细胞。我们对分化细胞进行免疫组化染色，结果显示，与对照组相比(图4B)，IL-12增加CSCs分化标志CK20表达(图4A)，同时降低 CSCs CD133+CD44+SW480比例(图4C)，说明其可能促进CSCs分化。

图3 慢病毒-IL-12转染细胞后，IL-12表达及对细胞自我更新的影响Fig．3 IL-12 expression and it’s effects on cell self-renewal after lentivirus/IL-12 transfected in cell

图4 IL-12促进结肠CSCs分化Fig．4 IL-12 promote colon CSCs differentiation

3 讨论

最近研究表明，CSCs能够始发免疫缺陷小鼠肿瘤生长［1，2］，并与肿瘤转移及复发相关。从理论上讲，靶向CSCs治疗能够彻底消除肿瘤复发及转移，因此靶向CSCs的肿瘤治疗策略将比目前的传统治疗方法能更有效地根治肿瘤，减少复发和转移的发生率，为肿瘤的靶向诊治提供了新靶标，为根治肿瘤带来了新希望。关于CSCs特异性的表面标志物目前尚无定论，根据目前国内外相关文献报道，采用双抗体标记CSCs也许是一种更好的选择，因此本研究我们联合CD133和CD44两种抗体富集CSCs，并且发现经条件培养的SW480结肠癌细胞经流式细胞分选后CD133CD44阳性表达率为(90.8±4.5)%，通过无血清成球、增殖、克隆形成和小鼠体内致瘤能力对其“自我更新能力”进行了初步鉴定，证实结肠癌SW480存在CSCs。

免疫抑制仍是多数预期较好的肿瘤治疗手段的主要障碍，而细胞因子失衡是机体免疫功能紊乱的主要原因，并导致肿瘤进展及复发。关于细胞因子的抗瘤免疫反应相关研究包括 IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-12等，已有研究表明，IL-12能有效地增多肿瘤的抗瘤免疫反应，但IL-12对CSCs是否同样有作用并不清楚。

慢病毒载体来源于人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIVⅠ)病毒，包装后能产生携带目的基因的重组慢病毒(是一类缺陷病毒)，离开包装细胞后病毒颗粒仅能转导细胞，但不能自我复制，此为其安全性提供了更为有效的保证。慢病毒载体既能感染分裂活跃期的细胞，又能高效率感染分裂缓慢或非分裂期的细胞;能够携带较大及多个外源性基因，转染后对转录沉默作用有较强的抵抗力，能长期稳定表达目的基因;另外还具有感染效率高、免疫反应低等特点。根据慢病毒载体的特性，本研究选用慢病毒作为携带目的基因的载体。

本研究中，我们成功构建含IL-12 cDNA的重组慢病毒质粒，用包装病毒的工具细胞293T细胞包装纯化后，获得较高滴度的病毒颗粒，将其转染CD133+/CD44+SW480细胞，慢病毒-IL-12细胞高表达IL-12 mRNA及蛋白，说明稳定转染IL-12的结肠CSCs系建立，同时也证明慢病毒作为基因研究的载体具有低毒、高效的优势。体外实验证实，IL-12促进分化标志CK20表达，降低CD133+CD44+SW480细胞比例，说明IL-12可促进结肠CSCs分化;另一方面，IL-12抑制结肠CSCs成球，说明IL-12可抑制结肠CSCs增殖。本研究为进一步研究IL-12对结肠CSCs恶性表型的影响奠定基础，为细胞因子进行CSCs治疗提供实验依据。

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